甘肅東部地區(qū)羊接觸傳染性膿包皮炎PCR方法的檢測(cè)和應(yīng)用

張 莉，豆思遠(yuǎn)*，任章章

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046；2.隴南市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 隴南 742500）

羊接觸傳染性膿包皮炎是由傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）感染綿羊、山羊引起的一種急性、高度接觸性的人畜共患病[1]。主要特征是唇、鼻、眼瞼、乳房、四肢皮膚及口腔黏膜出現(xiàn)丘疹、水皰、膿皰和痂皮等[2]。該病多發(fā)生在一歲以內(nèi)的羔羊，其中3～6月齡羔羊是最易感。ORFV抵抗力十分頑強(qiáng)，可持續(xù)多年對(duì)羊群造成危害[3]，已是影響我國(guó)乃至世界公共安全衛(wèi)生的一個(gè)重要隱患。ORF在世界各地羊群頻繁發(fā)生且常呈群發(fā)性流行[4]。

20世紀(jì)70年代國(guó)內(nèi)外就開(kāi)始ORFV分子生物學(xué)研究，自2004年Delhon揭開(kāi)ORFV全基因組研究序幕[5]，2006年Mercer揭示ORFV基因組兩末端區(qū)部分反向重復(fù)序列存在高度變異性[6]。隨著研究深入，ORFV基因組結(jié)構(gòu)、特性及其功能因子等逐步得到明確。本研究針對(duì)ORFV全基因序列中較保守的B2L設(shè)計(jì)引物，建立PCR診斷方法。為確定建立的PCR診斷技術(shù)檢測(cè)羊接觸傳染性膿包皮炎病毒（ORFV）基因的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)甘肅省平?jīng)鍪腥A亭縣、慶陽(yáng)市環(huán)縣和鎮(zhèn)原縣、慶陽(yáng)市和張掖市肅南裕固族自治縣的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，旨在確定該診斷技術(shù)在臨床快速檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品 血樣采自甘肅省平?jīng)鍪腥A亭縣、慶陽(yáng)市環(huán)縣和鎮(zhèn)原縣、慶陽(yáng)市和張掖市肅南裕固族自治縣的養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶。每只羊經(jīng)頸靜脈無(wú)菌法采取新鮮血液8 ml，按1:5抗凝劑與血液體積比加入ACD（100 ml抗凝劑中含檸檬酸0.48 g，檸檬酸三鈉1.32 g，葡萄糖1.47 g）抗凝。所有血液樣品分裝并保存于-70℃。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑（Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP），DNA Marker、瓊脂糖等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；ddH2O（雙蒸水，Distillation-Distillation H2O），70%乙醇，異丙醇溶液（-20℃預(yù)冷），6mol/LNaI溶液，氯仿-異戊醇（24:1）溶液，醋酸鈉溶液（3mol/L）等均為為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 TGL-18B-C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），TC-700 PCR儀（Funglyn Biotech Inc生產(chǎn)，上海楓嶺生物技術(shù)有限公司供貨），凝膠成像系統(tǒng)-TC-240（上海天呈科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 羊基因組DNA提取 嚴(yán)格按照NaI法提取靜脈抗凝血ORF病毒DNA[7]，提取羊基因組DNA后經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將基因組冷凍保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank收錄的羊序列（B2L）設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成[8]。

引物序列如下：

上游引物：5′-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3′

下游引物：5′-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3′

反應(yīng)體系如下（表1）：

表1 ORFV基因的擴(kuò)增體系

1.2.3 PCR擴(kuò)增

離心混勻后置PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)。擴(kuò)增程序如下（表2）：8.0 ml PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.0 ml上樣緩沖液離心混勻后，經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其完整性良好，證明從羊全血中獲得基因組DNA。

2.2 ORFV基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ORFV基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在540 bp的位置出現(xiàn)特異條帶，條帶清晰，表明成功獲得目的DNA片段。

2.3 PCR檢測(cè)ORFV的結(jié)果

表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，四個(gè)縣的羊接觸傳染性膿包皮炎陽(yáng)性檢出率分別為23.74%、14.56%、41.06%、9.78%。

環(huán)縣羊接觸傳染性膿皰皮炎檢測(cè)陽(yáng)性率逐年降低，由34.78%降至15.02%。

3 討論

從表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見(jiàn)，四個(gè)縣的的羊接觸傳染性膿包皮炎陽(yáng)性檢出率從9.78%～41.06%，差別很大，從一定程度了反映了該病在不同地區(qū)流行和發(fā)病的高低。鎮(zhèn)原縣和華亭縣較低，反映了這兩個(gè)縣近些年肉羊養(yǎng)殖規(guī)?；潭雀?，羊只流通監(jiān)管力度強(qiáng)有關(guān)；肅南縣血液采集自傳統(tǒng)牧區(qū)皇城鎮(zhèn)，羊只飼養(yǎng)量大，流通頻繁，23.74%的陽(yáng)性檢出率也和近年羊接觸傳染性膿包皮炎發(fā)病情況一致；環(huán)縣近幾年大力開(kāi)展肉用羊只和絨山羊養(yǎng)殖，同時(shí)在進(jìn)行灘羊改良，新建羊場(chǎng)、羊群較多，引種、流通頻繁，這些因素都能加速該病擴(kuò)散，使當(dāng)?shù)仃?yáng)性檢出率高。

表2 ORFV基因的擴(kuò)增程序

表3 2013年ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率

這四個(gè)縣的羊只飼養(yǎng)量大、分布廣，血樣采集的隨機(jī)性很大，加之血樣采集時(shí)間的不同，都可能使測(cè)定數(shù)據(jù)有偏差，這需要增加血樣采集區(qū)域、提高采集頻率，來(lái)提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)性。

從表4可見(jiàn)，隨著近年來(lái)防控和治療方法的普及，環(huán)縣羊接觸傳染性膿皰皮炎檢測(cè)陽(yáng)性率逐年降低，一方面是養(yǎng)殖戶在日常管理、圈舍消毒、病羊隔離、糞便無(wú)毒處理和科學(xué)化引種、配種方面防病意識(shí)加強(qiáng)，另一方面是結(jié)合PCR診斷檢測(cè)結(jié)果，對(duì)羊接觸傳染性膿皰皮炎陽(yáng)性率高的羊場(chǎng)重點(diǎn)開(kāi)展治理，如建立檔案進(jìn)行羊只追蹤、限制活羊流通等手段，從源頭上控制了該病傳播、擴(kuò)散。

表4 2014-2016年ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率