酸棗自由態和結合態多酚對人主動脈平滑肌細胞表型轉化的影響

李漢卿，劉豐銘，單樹花，魯 洋，張曉莉，李卓玉,,*

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006 ；2.山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006 ）

動脈粥樣硬化是導致心腦血管疾病的重要誘因之一，是一種多因素導致的慢性疾病，動脈粥樣硬化發病誘因主要有2 個方面：一方面為血管內膽固醇等脂質的積累，逐漸引起動脈粥樣硬化，導致腦中風和冠心病等[1-2]；另一方面為機械、炎癥等原因導致血管內皮損傷[3]。人主動脈平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cell，HASMC）是主動脈中膜的主要組成部分[4]，存在收縮型和合成型2 種不同表型：收縮型分化程度高，細胞呈紡錘樣細長梭形，增殖和遷移能力較弱，正常成熟血管壁表現為該類型[5-7]；而合成型分化程度較低，細胞肥大呈峰谷狀生長，增殖和遷移能力較強。動脈粥樣硬化中期形成動脈粥樣斑塊，主要是HASMC由收縮型轉化為合成型后，合成型的血管平滑肌細胞經過損傷的內膜，從血管壁中層遷移到內膜。遷移后合成型的血管平滑肌細胞增殖并吞噬低密度脂蛋白[8-10]等脂類蛋白，形成血管平滑肌細胞源性泡沫細胞[11]，從而促進動脈粥樣硬化的進程，引發心腦血管疾病。由此可見，HASMC表型轉化是促進動脈粥樣硬化的重要因素，也是當今研究熱點之一。

酸棗（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow）別名野棗，棗屬植物，是棗的原生種，在我國分布較廣[12-13]，是生長于我國北方的野生藥用植物資源，有著很高的營養價值和藥用價值，富含糖、有機酸、維生素和多種酚類化合物[14]。研究表明，酸棗仁味甘性平，具有安神鎮靜作用，富含脂肪酸類、三萜類和黃酮類等成分，是治療動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高頻藥物之一[15-16]；酸棗葉中提取到的酸葉酮、蘆丁等成分可以治療冠心病等心腦血管疾??；酸棗肉中富含許多可溶性糖、多種有機酸、礦質元素[17]和氨基酸等營養成分，對于動脈粥樣硬化的治療也有一定作用。近年來，有研究證明酸棗具有防病抗衰老與延年益壽的作用[18]，這些與酸棗中的多酚類物質密不可分。

本實驗以酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉為原材料，運用不同方法提取自由態和結合態多酚，對其不同方法提取的多酚質量濃度進行了測定，并研究了各種多酚對HASMC表型轉化的影響，為動脈粥樣硬化的預防和治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗葉、酸棗肉和酸棗仁 國藥控股國大藥房山西益源連鎖有限公司。

HASMC 美國模式培養物集存庫；DMEM/F-12（HAM）1∶1培養基 美國Biological Industries公司；無支原體胎牛血清 美國Gibco公司；噻唑藍、福林-酚試劑、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記鬼筆環肽、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 北京索萊寶科技公司；二甲基亞砜 美國Amresco公司；胰蛋白酶 北方同正公司；血管緊張素II（angiotensin II，AngII） 上海阿拉丁試劑有限公司；乙醇、碳酸鈉、沒食子酸、氫氧化鈉等均為進口分裝或國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

5417離心機 德國Eppendorf公司；756MC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國Millipore公司；CO2細胞培養箱、真空冷凍干燥機 美國Thermo公司；Delta Vision Elite系統 美國Applied Precision公司；倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；真空旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；細胞培養板 美國Hyclone公司。

1.3 方法

1.3.1 酸棗多酚的有機溶劑法提取

樣品預處理：酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉用組織研磨儀粉碎為粉末狀。

自由態多酚提?。悍謩e稱取酸棗肉粉、酸棗仁粉和酸棗葉粉各10 g，加入適量預熱的體積分數70%的乙醇溶液，攪拌均勻后靜提1 h，然后將混合物5 000 r/min離心10 min，收集上清液。重復上述方法，收集上清液。將2 次收集的上清液混合后在80 ℃旋轉蒸發除盡乙醇，最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥即相應為酸棗肉自由態多酚（Ziziphus jujuba flesh free polyphenol-ethyl alcohol，ZSFFP-E）、酸棗仁自由態多酚（Ziziphus jujuba seeds free polyphenolethyl alcohol，ZSSFP-E）、酸棗葉自由態多酚（Ziziphus jujuba leaves free polyphenol-ethyl alcohol，ZSLFP-E）。在-20 ℃保存，使用時用超純水溶解。

結合態多酚提?。簩⑻崛⊥曜杂蓱B多酚的酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉沉淀按如下2 種方法消化：1）加入100 mL NaOH消化；2）加入100 mL的甲醇和濃硫酸配制的混合溶液消化，在室溫下用磁力攪拌器充分攪拌2 h，然后在混合物中加入適量HCl，調pH值至7，終止消化。然后將混合物在11 000 r/min離心10 min，取上清液。在上清液中加入等體積的乙酸乙酯后充分攪拌，11 000 r/min離心10 min，重復5 次充分除脂。將多酚提取液在70 ℃旋轉蒸發除盡有機溶劑后停止，最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥，分別得到6 種結合態多酚：酸棗肉結合態多酚-法1（ZSFBP-1-E）、酸棗仁結合態多酚-法1（ZSSBP-1-E）、酸棗葉結合態多酚-法1（ZSLBP-1-E）、酸棗肉結合態多酚-法2（ZSFBP-2-E）、酸棗仁結合態多酚-法2（ZSSBP-2-E）、酸棗葉結合態多酚-法2（ZSLBP-2-E）。在-20 ℃保存，使用時用超純水溶解。

1.3.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中多酚質量濃度的測定

采用福林-酚比色法，以沒食子酸為標準品，標準液的質量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL。將1 mL樣品移入離心管，12 000×g離心15 min。加100 μL標準液或樣品和400 μL去離子水到試管中。加100 μL福林-酚試劑，混勻靜置6 min。然后加1 mL的7% Na2CO3和0.8 mL去離子水，混勻靜置90 min。用紫外-可見分光光度計在760 nm波長處檢測吸光度。以吸光度為橫坐標，沒食子酸質量（mg）為縱坐標作標準曲線。標準曲線方程為y＝0.443 1x+0.016 1（R2＝0.998 9），通過標準曲線計算樣品中多酚的質量濃度。

1.3.3 細胞培養

HASMC培養于含10%胎牛血清的DMEM/F-12（HAM）1∶1培養基中，置于5% CO2、37 ℃的培養箱中培養。

1.3.4 細胞形態學觀察

用完全培養基培養細胞，經胰酶消化后制成細胞懸液，采用血球計數板進行計數，用無血清培養基適當稀釋細胞濃度至5 000 個/孔，接種到96 孔板中饑餓處理24 h，使細胞周期同步。然后棄去舊培養基，每孔加入100 μL含有多酚和10-6mol/L AngII的完全培養基，每種多酚設置5 個平行孔，待處理24、48 h后，在倒置顯微鏡下觀察HASMC的表型轉化情況，并在拍照視野內隨機選取50 個細胞測量其長度和寬度，求其平均值。

1.3.5 細胞熒光染色觀察

將蓋玻片酸泡過夜，蒸餾水沖洗干凈，浸泡于體積分數70%乙醇溶液中，使用時將蓋玻片上乙醇燒干，鋪于12 孔板中，將用無血清培養基稀釋好的濃度為20 000 個/mL的HASMC鋪于12 孔板中，饑餓處理24 h。待處理完成后棄掉無血清培養基，分別加入1 mL含10-6mol/L AngII的完全培養基，然后加入ZSSBP-2-E、ZSLFP-E，終質量濃度分別為0.15、1.5 mg/mL，處理48 h。吸棄培養基，用37 ℃預熱的pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，每孔加入600 μL免疫熒光固定液固定10 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加入500 μL 0.5% TritionX-100溶液透化處理5 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L FITC標記的鬼筆環肽工作液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L DAPI溶液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。在載玻片中央滴加適量抗熒光猝滅劑，將蓋玻片從12 孔板中取出倒置在載玻片上，封片劑封片后用Delta Vision Elite系統觀察HASMC表型轉化情況。

1.4 數據統計分析

所有數據均為3 次獨立實驗的結果，以平均值±標準差表示。數據經SPSS 17.0軟件統計分析，組間差異分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉自由態及結合態多酚質量濃度

表1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中自由態和結合態多酚質量濃度Table 1 Contents of free and bound polyphenols in the flesh,seeds and leaves

由表1可知，酸棗葉中多酚質量濃度排序依次為：ZSLFP-E＞ZSLBP-2-E＞ZSLBP-1-E；酸棗肉中多酚質量濃度排序依次為：ZSFFP-E＞ZSFBP-1-E＞ZSFBP-2-E；酸棗仁中多酚質量濃度排序依次為：ZSSFP-E＞ZSSBP-1-E＞ZSSBP-2-E。酸棗肉、酸棗仁和酸棗葉中自由態多酚質量濃度均高于結合態多酚。自由態多酚中ZSLFP-E得率最高，結合態多酚中ZSLBP-2-E得率最高。

2.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉多酚對HASMC表型轉化的影響

圖1 倒置顯微鏡下觀察6 種結合態多酚對HASMC表型轉化的影響（24 h）Fig. 1 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (24 h)

表2 圖1中細胞的長度和寬度Table 2 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 1

圖2 倒置顯微鏡下觀察6 種結合態多酚對HASMC表型轉化的影響（48 h）Fig. 2 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (48 h)

表3 圖2中細胞的長度和寬度Table 3 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 2

圖3 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態多酚對HASMC表型轉化的影響（24 h）Fig. 3 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (24 h)

表4 圖3中細胞的長度和寬度Table 4 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 3

圖4 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態多酚對HASMC表型轉化的影響（48 h）Fig. 4 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (48 h)

表5 圖4中細胞的長度和寬度Table 5 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 4

用提取的9 種多酚（終質量濃度0.25 mg/mL）分別處理HASMC 24、48 h并觀察其表型轉化。6 種結合態多酚處理組與對照組、AngII處理組對比，ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態明顯向收縮型轉變（圖1、表2），ZSLBP-1-E影響HASMC的存活率，因此未統計HASMC細胞表型轉變；隨時間的延長，ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態進一步向收縮型轉變（圖2、表3）；3 種自由態多酚處理組與對照組、AngII處理組對比，ZSLFP-E處理組的HASMC形態明顯向收縮型轉變（圖3、表4）；隨時間的延長，ZSLFP-E處理組的HASMC形態進一步向收縮型轉變（圖4、表5）。以上結果表明，9 種多酚中，ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC明顯由合成型轉變為收縮型，并且呈現時間依賴性。

2.3 不同質量濃度ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉化的影響

圖5 倒置顯微鏡觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉化的影響Fig. 5 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with under an inverted microscope

表6 圖5中細胞的長度和寬度Table 6 Measurement results of the length and width of cells in Fig. 5

為了解不同質量濃度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC形態的影響，用不同質量濃度梯度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E處理HASMC并觀察其表型轉化，隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質量濃度的增加，HASMC形態向收縮型轉變更加明顯（圖5、表6），同時隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質量濃度的增加，收縮型細胞數量在增加。以上結果表明：ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC由合成型轉變為收縮型，并且呈現質量濃度梯度依賴性。

2.4 熒光染色實驗觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型轉化的影響

圖6 Delta Vision Elite觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉化的影響Fig. 6 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with free polyphenols from leaves and bound polyphenols from seeds obtained by acid digestion under Delta Vision Elite system

為了更加直觀地觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型的轉化作用，用FITC標記鬼筆環肽對HASMC細胞骨架進行染色，用DAPI對HASMC細胞核進行染色，通過Delta Vision Elite系統觀察HASMC形態。由圖6可知，用ZSLFP-E和ZSSBP-2-E兩種藥物分別處理HASMC后，細胞形態明顯向收縮型轉變。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，其發病誘因多種多樣，如不良習慣、肥胖、高血壓、糖尿病等[19-22]，而HASMC的形態變化是重要內因之一。HASMC存在收縮型和合成型2 種不同表型，收縮型增殖、遷移能力較弱，細胞呈現紡錘樣細長梭形，合成型細胞增殖、遷移能力較強，細胞肥大呈峰谷狀生長。不同的刺激可能引起HASMC由收縮型轉變為合成型，并開始遷移、增殖，從而促進動脈粥樣硬化的形成[23]。近幾年來，對于HASMC表型轉化的研究是熱門之一，植物中有效成分對于HASMC表型的轉化已有很多報道，如具有降血壓、抗氧化、神經保護等作用的姜黃素[24-25]，可以促進主動脈平滑肌細胞由合成型向收縮型轉變[26]。而多酚對于影響HASMC表型轉變的研究也有許多。如鄔秋德等[27]的研究表明黃酒多酚可以抑制同型半胱氨酸誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞表型的轉化，從而能夠預防一些心血管疾病的發生。

因此，本實驗通過不同方法提取酸棗不同部位（酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉）的自由態和結合態多酚，并用提取的多酚進行體外實驗，研究其對HASMC表型轉化的影響。首先通過多酚的提取和測定，發現酸棗葉中的自由態多酚質量濃度遠高于其他部位提取的自由態多酚，且酸棗葉中用甲醇和濃硫酸混合液消化法提取的結合態多酚質量濃度遠高于其他部位提取的結合態多酚。在所提取的9 種多酚中，ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可明顯促進HASMC由合成型向收縮型轉變，且呈現良好的時間和劑量依賴性。因此，這兩種多酚對于實際生活中預防和治療動脈粥樣硬化有很好的研究價值。未來可針對這兩種藥物深入探討其發揮功效的單一組分，并且研究其影響HASMC形態調控的基因，以期提供低毒、高效的預防動脈粥樣硬化的保健品和新型藥物。