氧化鐵納米顆粒示蹤干細胞的臨床轉化研究進展

謝園園，劉 碩，王 斌

(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 臨床干細胞研究室，江蘇 南京 210008)

1 前 言

近年來，涉及納米技術的研究成果呈現(xiàn)指數(shù)級增長，納米材料在電子學、光學、自動化技術、紡織、石油、天然氣和生物醫(yī)學等領域得到廣泛應用[1-4]。在所有類型的納米顆粒中，磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNPs，直徑10～100 nm)，因其尺寸和形狀可調節(jié)、合成方法簡單、具有相對較大的比表面積以及可攜帶多種生物配體的特性等，在醫(yī)學研究中關注度較高[5]。MNPs由鐵、鈷、鎳和鋅等磁性材料組成[6]，包含多種金屬化合物，例如Fe3O4、Fe2O3、NiFe2O4和FeCo，從而具有不同的磁性[7]。

眾所周知，鐵是所有生物體必須的礦物質，是人體中天然存在的金屬元素，具有多種重要功能，比如：是血紅蛋白的關鍵組成部分，可為組織攜帶氧氣，促進維生素B族代謝以及促進嬰幼兒智力發(fā)育等。MNPs中的氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles，IONPs)，具有獨特的磁性和優(yōu)異的生物相容性[8]，在醫(yī)學領域應用非常廣泛，包括貧血患者的補鐵劑[9]、磁性細胞或分子分離技術[10]、磁性靶向藥物和基因傳遞載體[11]、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影劑[12]、磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia，MFH)[13]和干細胞生物學應用[14]等等。

IONPs的功能核心是納米結構的氧化鐵分子，最常用的氧化鐵是磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γ-Fe2O3)和赤鐵礦(α-Fe2O3)[15]。裸的IONPs顆粒易于發(fā)生化學反應而聚集成團，而且可能有毒，因此IONPs一般會被有機或無機涂層包裹，并且可以用第二層或更多層改性第一涂層以提供特定的功能，從而減少氧化鐵氧化、防止納米粒子聚集及提高生物相容性[16]。醫(yī)學生物學領域中最常用的是有機涂層，包括檸檬酸鹽、葡聚糖、聚乙二醇、殼聚糖、聚乙烯亞胺、磷脂和共聚物等等[17]，并且涂層外表還可以通過物理或化學的方法綴合與特異性受體結合的靶向分子(即配體或抗體)，也可以加載特定的藥物化學分子，如蛋白質和遺傳物質的治療劑，用于某些醫(yī)學目的[18]。

當核心IONPs顆粒尺寸小于臨界尺寸(通常為10～15 nm)時，在一定溫度范圍內顆粒將表現(xiàn)出超順磁性[19]，稱之為超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)。超順磁性是指整個粒子表現(xiàn)為順磁原子的狀態(tài)，例如，該單疇粒子的磁矩與外部磁場對齊[20]，通常MRI是觀察SPIONs的首選技術。MRI是一種功能強大且應用廣泛的醫(yī)學成像方法，具有極高的成像靈活性、優(yōu)異的空間分辨率，可避免電離輻射，患者接受度高，并且能夠評估解剖學和生理學參數(shù)，獲得獨特的臨床信息，是醫(yī)學領域中最有效的診斷工具之一[21]。此外，用于MRI成像的SPIONs，一般具有可生物降解的碳水化合物表層和氧化鐵納米顆粒核心，可以提供強烈的對比度區(qū)分移植體內的SPIONs標記的干細胞和周圍宿主組織[22]，也成為近年來科學家們提出的一種新興的干細胞示蹤檢測技術——將MRI和SPIONs應用結合評估干細胞在體內的命運，目前已被提出作為監(jiān)測植入體內的干細胞生物分布和遷移的金標準[23]。

2 SPIONs在MRI的臨床應用中的發(fā)展過程

目前SPIONs用于臨床成像已經(jīng)超過20年，本文將詳細介紹以往和當前被批準臨床應用的SPIONs的發(fā)展過程及各自特點。1995年，第一個用以MRI成像的SPION被開發(fā)出來，其流體動力學半徑是100～150 nm，是由5～10 nm的氧化鐵核心和葡聚糖分子包被的表面組成[24]。但是在不斷的研究與應用中，發(fā)現(xiàn)其安全性、生物相容性、MRI的靈敏度以及與成像裝置的兼容性都需要進一步改進。隨后，不斷有研究報道逐漸優(yōu)化的SPIONs的合成方法和工藝，基于其制備了多種質量較高、成本較低的納米顆粒材料。

2.1 SPIONs的合成方法

2.1.1 堿性溶液共沉淀法

在堿性溶液中共沉淀Fe2+(亞鐵離子)和Fe3+(鐵離子)是公認的、常規(guī)的SPIONs合成方法[10,25]，通過在非氧化環(huán)境中添加堿性溶液(如反應方程式(1))，在穩(wěn)定劑存在下，使用定比例的Fe2+和Fe3+鹽溶液，通過沉淀法形成Fe3O4納米顆粒。根據(jù)用于共沉淀的懸浮液的pH值和氧含量，F(xiàn)e3O4可以通過各種電子或離子轉移轉變成γ-Fe2O3(如反應方程式(2))，同時可以在溶液中加入不同的化合物涂覆在SPIONs表面[26]。通過改變前驅體鹽濃度、穩(wěn)定劑、反應時間和pH，可以實現(xiàn)對粒度、磁性和膠體穩(wěn)定性的高度控制。

Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O

(1)

Fe3O4+2H+→γ-Fe2O3+Fe2++ H2O

(2)

這些類型的SPIONs目前已得到了廣泛的研究，并成功轉化到臨床[25,27]。該方法可用于SPIONs的大規(guī)模生產(chǎn)，但缺陷是較難獲得尺寸均一和磁性穩(wěn)定的納米鐵顆粒核心[28]。Chen等[29]提出了一種稱為“水冷卻和磁性內部加熱共沉淀”的物理輔助策略優(yōu)化合成SPIONs的方法。共沉淀制備過程按順序分為成核、生長和成熟3個部分，而加熱是為納米晶體生長和成熟階段提供足夠的能量，用優(yōu)化工藝制備的SPIONs的晶體結構得到了極大的改善，粒度分布更均勻，磁性能顯著提高。

2.1.2 熱分解法

在封端劑(例如油酸和油胺)存在下，將鐵的有機化合物(例如五羰基鐵Fe(CO)5、油酸鐵Fe(acac)3或FeOOH)熱分解可獲得SPIONs，通過改變反應中試劑的比例可以控制SPION的尺寸、形狀和分散性以及磁性等[30-33]。但主要缺點是合成的SPIONs是疏水性的，需經(jīng)多步驟、繁瑣的表面修飾才可以將它們改變成親水性顆粒，從而改善其生物學功能[28,34]。目前多篇文獻報道了在IONP的化學修飾中，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是具有高電荷密度的陽離子聚合物，其氨基基團片段可以產(chǎn)生具有正電荷和聚集穩(wěn)定性的納米顆粒，常被用作多功能封端劑和活性穩(wěn)定劑，對納米顆粒的流體動力學具有顯著影響，并且可提高其在MRI中的弛豫率和靈敏度[35]。但是缺點是PEI能夠與帶負電荷的細胞膜相互作用,并通過胞吞作用進入細胞中，對細胞具有高毒性[36]。而將水溶性聚合物聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)與PEI結合產(chǎn)生的PEI-PEG共聚物，不僅可以增強IONPs的水溶性,還可降低PEI的毒性[37]。

2.1.3 微乳液法

聚(L-丙交酯)(poly(L-lactide)，PLLA)是一種在醫(yī)療應用中長期使用并且安全的聚合物，是完全可生物降解的[38]。近年來有文獻報道通過微乳液法合成氧化鐵-PLLA納米粒子[39]，這種合成方法的優(yōu)點是可以將不同濃度和類型的氧化鐵引入納米顆粒中進一步優(yōu)化MRI性質，并可將熒光染料嵌入聚合物中。此種方法合成的納米顆粒具有負Zeta電位(-29和-44 mV之間)，直徑為110～135 nm[40]。

2.1.4 其他合成方法

很多文獻報道了合成具備所需形狀、尺寸和磁性的氧化鐵納米顆粒的其他方法。其他不太常用的合成方法包括水熱反應和溶膠-凝膠合成法[27]。

對于在生物醫(yī)學中的應用，SPIONs在水中的穩(wěn)定性、對人體的無毒性以及體內可生物降解性至關重要。一般來說，F(xiàn)e3O4核的SPIONs因更易合成而被廣泛研究，但是有報道認為Fe3O4會分解成γ-Fe2O3，可能會在標記干細胞過程中引起毒性問題[41]，因此研究人員一般會在標記干細胞前預氧化微粒[42]。一般認為γ-Fe2O3在化學性質上更穩(wěn)定并且對干細胞的毒性較小，但對兩種成分尚未進行詳細研究與比較，可能由于大多數(shù)合成的SPIONs是兩者的混合物[33]。

2.2 曾經(jīng)或正在批準用于臨床成像的SPIONs

作者查閱大量文獻后，總結了曾經(jīng)或正在批準用于臨床成像的SPIONs，列于表1。第一個上市的SPIONs是AMAG Pharmaceuticals公司研發(fā)的右旋糖酐包被的流體動力學直徑為50～100 nm的Endorem?，通用名稱為Ferumoxides AMI-24，其1996年在美國上市，曾被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于肝部損傷及某些腫瘤的MRI造影劑，最終于2008年撤市[43]。同一個公司研發(fā)的Combidex?/Sinerem?(低分子量右旋糖酐包被，20～50 nm)，2005年在歐洲上市，但僅僅兩年后就被撤市[44]。此外還有，Resovist?(聚葡萄糖山梨醇羧甲基醚包被，60～80 nm)和Clariscan?(氧化低聚淀粉包被，直徑為11～15 nm)，由于安全問題，現(xiàn)均已被停產(chǎn)[45,46]。詳細內容見表1。

表1 已被批準用于臨床或正處于臨床試驗的SPIONsTable 1 SPIONs approved for clinical application and in clinical trails

目前，可臨床應用的SPIONs顆粒有FDA批準的Ferumoxytol(Feraheme?，AMAG Pharmaceuticals)、中國FDA(China FDA，CFDA)批準的瑞存以及在歐洲國家撤市而在日本仍用于肝臟成像的SPIONs顆粒Resovist?[47,48]。Ferumoxytol是FDA批準的唯一靜脈注射的超小SPION(ultra SPION，USPIO)顆粒，直徑為17～31 nm，由氧化鐵晶體核心(直徑(6.76±0.41)nm)和親水性羧基葡聚糖涂層組成，最初被FDA批準用于靜脈治療慢性腎病患者缺鐵性貧血的鐵補充劑[49]。由于其在血管內半衰期長達14～15 h[50]，近些年作為MRI的靜脈造影劑得到廣泛的研究，同時也用于細胞標記。Ferumoxytol對T1和T2加權的MRI圖像具有強烈的信號效應，反映的縱向r1和橫向r2松弛度分別為15和89 mM-1·s-1[51]，與其他USPIO相比，F(xiàn)erumoxytol較少發(fā)生過敏反應和特異性反應。

3 SPIONs標記干細胞的方法、臨床前安全性評價和臨床研究

干細胞因具有刺激病變宿主組織再生的能力而被廣泛地用于治療各種疾病和病癥。在再生療法中，對移植到體內的干細胞成像并追蹤其在體內的遷移和分布至關重要，可為評價干細胞的安全性和治療效果提供關鍵信息[55]。目前，臨床前成像技術如光學、光聲和MRI，通常涉及用探針或造影劑標記細胞，使其與宿主細胞區(qū)分開來[56]。在臨床上，MRI穿透深度和空間分辨率等優(yōu)勢使其成為干細胞成像的首選方法，其避免了有創(chuàng)性檢查，并且是可重復的。一般將患者或組織樣本放置在臨床上常用的1.5 T、3 T以及臨床前高達21 T的設備的強外部磁場位置，通過MRI掃描儀來可視化活體組織或細胞。

SPIONs作為干細胞標記示蹤劑與器官成像有著根本性的差異，后者是直接靜脈內施用SPIONs溶液，而前者是體外標記細胞后將其移植入患者和/或動物模型體內[33]。在兩種情況下鐵的使用劑量不能統(tǒng)一定論，評價體系也是不同的，并且要考慮SPIONs標記干細胞的方法以及不用種類細胞的差異性。

3.1 SPIONs標記干細胞的方法

SPIONs能否成功標記細胞，受粒子從細胞外環(huán)境穿梭到細胞內這一過程中各種因素的影響，標記效率取決于細胞膜特性以及標記細胞的大小。有些細胞類型允許對納米顆粒的有效攝取，并且僅通過簡單地將納米顆粒懸浮在培養(yǎng)基中孵育一定的時間即可成功標記。但是由于干細胞缺乏吞噬能力，內化的SPIONs量可能不足以用于細胞成像，所以通常使用物理方法或轉染劑(transfection agents，TA)涂覆帶負電的SPIONs顆粒，促進顆粒與陰離子細胞膜的結合，從而促進細胞對納米鐵顆粒的攝取[57]。常用的TA試劑包括脂質體(lipofectamine、SuperFect)、多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)和硫酸魚精蛋白(protamine sulfate)等[58]。

3.1.1 物理學方法標記

基于電穿孔、顯微注射或超聲脈沖[56,59,60]的物理學方法標記干細胞的原理是暫時破壞細胞膜穩(wěn)定性，細胞膜滲透性的瞬時變化允許納米顆粒穿過膜并進入細胞質。磁電/聲波穿孔的主要優(yōu)點是標記是瞬時的、不需要延長細胞的孵育時間，常用于標記一些敏感的原代細胞。然而，這種標記方式最大的缺陷是細胞死亡較多，并且需要針對每種細胞類型優(yōu)化參數(shù)[55]。Lei等使用聚焦超聲波的磁光子穿孔術(magnetosonoporation，MSP)標記神經(jīng)干細胞[61]，并且驗證了MSP標記干細胞的安全性。但是這些標記程序對干細胞生物學的長期影響需要更全面和徹底的評估。

此外，還有大量文獻報道，由于SPIONs的獨特磁性能，SPIONs和細胞膜之間的相互作用可以通過各種類型的磁場來控制。這種技術包括在細胞培養(yǎng)液中孵育SPIONs，并在培養(yǎng)瓶下面放置一個磁鐵，從而產(chǎn)生一個靜磁場(static magnetic field，SMF)，一方面力的作用將納米鐵顆粒“拉”進細胞內，同時SMF會導致內吞相關蛋白表達增加[62,63]，從而有更多的SPIONs進入細胞內，并且該過程不損害細胞活力。除SMF外[64]，研究表明脈沖磁場(pulsed magnetic fields，PMF)[65]和交變磁場(alternating magnetic field，AMF)[66]產(chǎn)生的磁力也可增加細胞的SPIONs攝取量。此外，有研究人員合成具有不同磁鐵礦載荷的磁性納米顆粒，評估磁力對納米顆粒吸收的影響，結果表明，內化速率取決于顆粒內的磁鐵礦水平[67]。

3.1.2 PLL復合SPIONs顆粒標記干細胞

PLL(分子量為 350～400 Da)是一種帶正電荷的合成氨基酸鏈，廣泛用作生物涂層，并且是第一種認定的聚合DNA轉染試劑，可將DNA濃縮成帶正電的顆粒。有文獻報道，PLL與氧化鐵納米顆粒復合后標記干細胞的效率高達80%[68]。作者課題組曾將Fe濃度為5 mg/mL的Ferumoxytol與濃度為100 μg/mL 的PLL復合后超聲，用Fe終濃度為200 μg/mL的復合物轉染人臍帶和人骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，效率均可達到100%，見圖1。但是也有文獻報道，SPIONs-PLL復合物進入細胞后可能會增加細胞內活性氧和羥基自由基的形成，從而增加細胞凋亡率，并且PLL的終濃度達到10 mg/mL時，可引起明顯的細胞死亡[69]，還有報告指出用SPIONs-PLL復合物標記MSCs抑制其軟骨分化能力[70,71]。因此針對不同的干細胞必須優(yōu)化出最佳的PLL和SPIONs的比率以及轉染濃度，轉染效率和細胞本身產(chǎn)生的毒性根據(jù)所應用的條件而變化。

3.1.3 硫酸魚精蛋白復合SPIONs顆粒標記干細胞

目前，大部分的干細胞示蹤研究中使用硫酸魚精蛋白(protamine sulfate，Ps)與Ferumoxytol復合來標記干細胞，結果表明單獨的Ferumoxytol與Ps直接復合不能有效地標記細胞[49,72]。將Ps先和肝素(heparin sodium，Hs)按比例混合，迅速通過靜電作用形成復合物[73]，然后再加入Ferumoxytol，三者即可形成穩(wěn)定的HsPsF納米復合物，可以高效率地標記干細胞。Ps是一種低分子量(～4000 Da)天然聚陽離子肽；Hs為FDA批準的抗凝血藥物[58]，細胞耐受性好，治療窗口寬(大于50 mg/mL)。HsPsF標記干細胞的主要優(yōu)點是這些藥物都是具有臨床資質的，因此不需要對復合物各種藥物成份進行廣泛的安全性檢測，縮短了臨床轉化時間。文獻中報道的高效的標記方法[74]是將HsPsF按照Hs(1～5 IU/mL)、Ps(30～60 μg/mL)、Ferumoxytol(50～100 μg/mL)的順序依次加入無血清培養(yǎng)基中混合，配置成復合物后加入細胞中培養(yǎng)4 h，再加入血清至完全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h。作者課題組前期也采用HsPsF(濃度分別為5 IU/mL、60 μg/mL、100 μg/mL)的方法標記人臍帶MSCs，標記效率也達到100%，見圖1。HPF的標記方法中使用的Hs、Ps和Ferumoxytol的濃度均低于臨床推薦劑量。而且有文獻報道，HsPsF納米復合物具有與SPIONs相似的生物化學特性，可在標記細胞中通過鐵代謝途徑生物降解[75]。

圖1 Ferumoxytol標記人臍帶MSCs的普魯士藍染色圖：(a)對照組，(b)Ferumoxytol-PLL標記法，(c)HsPsF標記法Fig.1 Prussian blue staining images of Ferumoxytol labeled human umbilical cord MSCs:(a)control cell,(b)Ferumoxytol-PLL labeling method,(c)HsPsF labeling method

3.1.4 蛋白質電暈介導的SPIONs顆粒標記干細胞

Nejadnik等[76]將Ferumoxytol與含有人血清(Human serum，HS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基在溫育后通過離心除去過量和未結合的蛋白質后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌。將沉淀重懸于PBS后，以Fe終濃度100 μg/mL加入細胞中，標記人MSCs，細胞內平均鐵含量為(4.01±0.02)pg，在動物模型體內MRI T2弛豫時間相比于HPF標記方法明顯縮短。

無論使用何種標記方法，都需要檢測細胞的標記效率，一般采用普魯士藍呈色法定性觀察；用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察SPIONs在細胞內分布；采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES)檢測細胞內平均鐵含量。在ICP-AES檢測前需徹底清洗細胞以去除細胞表面所有過量的納米顆粒，因為殘留在細胞外的造影劑可能導致檢測結果偏高，而通過流式細胞術[77]分選后定量細胞內鐵含量的方法可以排除細胞外聚集體。最為精確的定量方法是用磁電泳檢測法[78,79]測量磁性納米顆粒的攝取，這種技術最初是由Zborowski等研究學者提出的，細胞磁電泳取決于高度規(guī)則的自旋鐵物質的存在并且產(chǎn)生細胞磁泳過程，通過測量細胞磁泳遷移率的平均值和分布的變化來計算細胞內鐵含量，此方法優(yōu)勢是既可排除細胞外聚集體，又能測量活細胞單個細胞中的磁性含量而非細胞群體的平均值。

3.2 SPIONs標記干細胞的臨床前研究——安全性評價檢測

SPIONs標記干細胞為干細胞體內示蹤提供了一種有望臨床轉化的工具，但是目前全世界并沒有批準用于臨床的干細胞標記造影劑，因此完善標記后的干細胞的安全性評價體系對于干細胞示蹤的臨床轉化至關重要。理想的臨床用細胞造影劑必須滿足以下標準[40]：① 標記的細胞移植體內后可觀察到的MRI信號強度與細胞量呈現(xiàn)對應趨勢關系；② 不影響細胞在體內的生存、擴增和遷移；③ 國際細胞治療協(xié)會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)定義的干細胞標準沒有變化；④ 干細胞未發(fā)生明顯影響療效的功能改變。而干細胞的來源、轉染試劑、標記技術、標記時間以及細胞內的鐵含量都有可能對標記后的細胞產(chǎn)生影響。

作者研究團隊結合國內外干細胞法規(guī)與質量標準，查閱相關的文獻，總結出SPIONs標記的干細胞需檢測的項目應包括：① 標記效率檢測；② 毒性檢測：形態(tài)、活率、凋亡、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、增殖、生長曲線和細胞周期等；③ 功能學檢測：表面標志物、分化潛能、集落形成能力、遷徙能力、免疫調節(jié)和基因芯片檢測等；④ 動物體內安全性檢測：致瘤性、炎癥反應和致死性等；⑤ MRI可視化：細胞水平以及動物體內可成像性。

目前不同的研究小組[40]已經(jīng)證實了不同的SPIONs標記的干細胞在體外和體內的MRI特性，然而，鐵標記對細胞的毒性和生物學功能影響存在爭議，一些研究小組報告了變化，而有些文獻則沒有觀察到任何統(tǒng)計學差異，強調了每種標記方法綜合評估的重要性。例如，有文獻報道Ferucarbotran標記干細胞促進細胞遷移能力[55]，而有的數(shù)據(jù)[74]卻顯示不影響；對于成脂和成骨分化潛能，有文獻表明沒有影響[70]，有的則報道對成骨分化潛能呈現(xiàn)劑量依賴性抑制，高濃度下成骨分化能力消失[80]。Gu研究組[81]用合成的SPIONs標記人骨髓MSCs細胞，研究表明其通過激活經(jīng)典MAPK通路調控的分子機制促進人骨髓MSCs成骨分化。在大多數(shù)研究中，SPIONs不會影響脂肪和神經(jīng)原性分化[70,82]；表型也不發(fā)生改變[74]。詳細內容總結于表2。

目前為止，還沒有一份特定MRI造影劑標記干細胞后的系統(tǒng)而全面的安全評價報告或指導性的文件。但是縱觀文獻，SPIONs標記的干細胞在一定的濃度范圍和孵育時間內基本是安全的，具有臨床應用可行性。因此，前期有些研究小組雖未經(jīng)過系統(tǒng)的安全評價體系，也已經(jīng)應用在臨床病人體內。

3.3 SPIONs標記干細胞的臨床研究和體內示蹤

2006年，第一篇報道SPIONs標記干細胞的文章發(fā)表在NewEnglandJournalofMedicine雜志上[96]。研究人員從一名34歲患者暴露的神經(jīng)組織(腦損傷區(qū)域)分離出自體神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)，后利用Feridex IV4(FDA批準的造影劑，2008年撤市)和Effectene(脂質轉染試劑)復合物標記，再將這些標記后的細胞再次植入患者腦損傷區(qū)域周圍。術后第24 h及每周進行MRI，共十周。植入后第一天，細胞移植的部位見圓形的暗組織區(qū)域；植入后第一周，信號的變化與細胞積聚和病變周圍細胞的增殖一致，第二和第三周病變周圍信號增強。第四周，NSCs已經(jīng)從注射的主要部位逐漸遷移到損傷組織邊界，7周后無信號。作者推測無信號的原因是細胞增殖及移植細胞向受損組織的邊緣遷移引起的信號稀釋。這項涉及兩名患者的初步臨床研究，證明了SPIONs標記干細胞移植的安全性以及MRI非侵入性檢測干細胞的移植和遷移的可行性，與動物模型中的臨床前數(shù)據(jù)一致。

2010年Karussis等進行了一項臨床研究[97]，項目注冊號是NCT00781872，目的是評估自體骨髓MSCs在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)和肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者中的可行性、安全性和免疫學作用。研究中涉及MS與ALS(脊髓)患者9例，將自體骨髓來源MSCs與Ferumoxide共孵育后，采用殼內注射與靜脈注射量為2∶1的方式移植標記干細胞。移植后第4～48 h、1個月、3個月和6個月分別進行MRI成像，患者隨訪至25個月。T2加權圖像結果表明，MSCs從腰椎(移植部位)向髓膜、脊神經(jīng)根和脊髓組織遷移。隨訪期間沒有發(fā)生不良反應。

2010年Jozwiak等在CellMedicine雜志發(fā)表論文[98]，研究中采用PLL修飾的Ferumoxide復合物，標記自體臍帶血來源神經(jīng)祖細胞，48 h后移植到發(fā)生缺血性腦損傷后7個月的16個月大的嬰兒腦室內，每個月連續(xù)注射3次細胞至大腦的側腦室中。移植后第1天、1周、1月、2月和4月后進行MRI成像，結果顯示移植后4個月內細胞沿著側腦室壁排列，沒有進入腦組織，隨訪到第6個月，神經(jīng)狀況略有改善，證明腦室內移植細胞是可行的，并且是耐受和安全的。

2014年，Janowski等在PLoSOne雜志發(fā)表文章[99]，他們同樣采用PLL修飾的Ferumoxide復合物，標記自體臍帶血來源神經(jīng)祖細胞，48 h后移植到嚴重腦缺血的18個月大的嬰兒側腦室前額角，腦室內注射約107個細胞。移植后第1天、1周、1月、2月、4月和33個月進行MRI成像，并在體外開發(fā)重力驅動的沉降測定和吸引細胞的磁場驅動。移植后24 h，MRI檢測到側腦室枕角中低信號的細胞，并且觀察到標記細胞可隨著外加磁場方向遷移，在整個成像周期內信號降低，第33個月時檢測不到信號。臨床數(shù)據(jù)表明，MRI成像可以檢測到側腦室內SPIONs標記的干細胞。

表2 臨床前研究中顯示的SPIONs標記對干細胞的影響Table 2 The effects of SPIONs labeling on stem cells in preclinical studies

Notes：H，human，人類；NM，not mentioned，未檢測；HUCB-MSCs，人臍帶血造血干細胞；Fe-Pro：Ferumoxytol-Protamin complex，F(xiàn)erumoxytol-硫酸魚精蛋白復合物；Cho：chondrogenic differentiation，成軟骨分化潛能；BM-MSC：bone marrow MSC骨髓間充質干細胞；Adi:adipogenesis differentiation，成脂分化潛能；HPF：肝素-魚精蛋白-Ferumoxytol復合物；Ost：osteogenic differentiation，成骨分化潛能；AEC:amniotic epithelial cells，羊膜干細胞；NPC：neural progenitor cells，神經(jīng)祖細胞；ADSC：adipose-derived stem cells，脂肪干細胞；CDCs：cardiosphere-derived stem cells，心臟球衍生的干細胞；PLL:poly-L-lysine,多聚賴氨酸；HEDP：1-Hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid羥基乙叉二膦酸；HNSCs:human neural stem cells，人神經(jīng)干細胞；PLLA：poly(L-lactic acid)，聚(L-丙交酯)。

4 結 語

本文介紹了基于SPIONs標記的干細胞示蹤的臨床轉化相關研究進展，包括SPIONs的合成方法、批準用于臨床的SPIONs的發(fā)展歷程、SPIONs標記干細胞的方法、標記后干細胞的安全評價以及目前已報道的干細胞示蹤的臨床試驗。SPIONs標記干細胞進行臨床轉化的流程見圖2。MRI示蹤成像SPIONs標記的干細胞具有堅實的臨床前研究基礎，臨床前細胞學評價、動物水平示蹤以及目前已開展的臨床試驗的初步結果顯示，SPIONs示蹤干細胞是一項非常有前途的技術并且值得臨床轉化，將極大推動移植干細胞在體內生物分布和歸巢不明這一難題的解決。

然而，在臨床轉化的過程中依舊有很多問題需要科學家們進一步地探索和解決：(1)MRI信號強度與標記細胞中的SPIONs量直接相關，移植到體內的標記干細胞可能會在體內增殖以及被宿主巨噬細胞吞噬，細胞內氧化鐵納米顆粒可能會逐漸稀釋并在體內生物降解，使得MRI檢測信號強度隨著時間的推移而降低，這可能會限制MRI檢測干細胞的時間，并且出現(xiàn)假陽性。未來的研究中，需要開發(fā)新的SPIONs，進一步建立符合良好生產(chǎn)規(guī)范(good manufacturing practices，GMP)、安全有效的干細胞標記方案來克服這些問題。(2)SPIONs標記的干細胞檢測閾值受多種因素的影響，包括磁場強度、信噪比、脈沖序列、粒子類型和大小等。目前的MRI設備和成像序列，對SPIONs標記細胞的定量是間接技術，信號變化反映的是磁性納米粒子的總體濃度，而不是實際的細胞總數(shù)。某些內源性病癥導致的低MR信號可能與磁性造影劑的存在相混淆。例如：在梗死的心肌中通常有含鐵黃素的巨噬細胞，其低信號與標記細胞沒有區(qū)別[100]。因此，開發(fā)靈敏度更高的成像設備以及成像序列至關重要。

圖2 SPIONs標記干細胞進行臨床轉化的流程示意圖 (Ⅰ：TA標記法；Ⅱ：物理學標記法；Ⅲ：蛋白質電暈介導標記法)Fig.2 Schematic diagram of clinical transformation of SPIONs labeling stem cells (Ⅰ:SPIONs/transfection agents complex method；Ⅱ:Physical labeling method；Ⅲ:Protein corona mediated labeling method)

用于標記干細胞的理想MR對比劑最好符合以下條件：低毒性、生物相容性、穩(wěn)定對比度、高靈敏度(單細胞檢測)、不隨著細胞增殖而稀釋，并且最小程度地向內源宿主細胞轉移[55]。雖然目前可用的磁性納米顆粒不能同時滿足這些標準，但可以通過MR的引導實時將干細胞遞送到患者體內，確保干細胞的初始移植和分布在解剖學上是準確的。干細胞的長期示蹤，有待于開發(fā)出SPIONs與MR特異性成像物質相結合的材料，不僅可以觀察到移植細胞是否存活,而且信號不會隨著細胞分裂而稀釋。