毛尖茶葉中的黃酮類化合物對脂氧合酶的抑制性

吳桂玲，代虹鏡，鄧維先，羅 駿

（黔南民族師范學院化學化工學院，貴州 都勻 558000）

脂 氧 合 酶 （lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗稱脂肪氧化酶，是廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中的一類非血紅素鐵蛋白。它專門催化具有順，順-1,4-戊二烯結構的不飽和脂肪酸的加氧反應，在植物體中脂氧合酶將亞油酸和亞麻酸轉化成氫過氧化脂肪酸[1-2]，最后由于其他酶的作用，產生了具有特殊風味的酯類物質[2]，比如說大豆的豆腥味，谷子的陳化[3]。因此，尋找高效、低毒的選擇性LOX 抑制劑已經成為一個重要的研究方向。黃酮類化合物是一類低分子量的廣泛存在于云祥科、唇形科、豆科等天然植物中，是植物重要的次生代謝產物。黃酮類化合物除具有抗炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮靜、利尿等作用外[4]，還在抗氧化方面、抗癌方面、抑制脂氧合酶方面等有顯著地效果[5-6]。因此黃酮類化合物的提取及其對脂氧合酶的抑制的研究等方面有重要意義。也可作為體外篩選天然抗腫瘤活性物質的一種有效方法。本文對都勻毛尖茶葉中的黃酮類化合物對大豆脂氧合酶的抑制作用進行研究。為天然抗氧化劑(黃酮類化合物)的提取及其對脂氧合酶(LOX)抑制機理的研究奠定了基礎，為合理應用黃酮類化合物對脂氧合酶的特殊作用來保鮮水果、蔬菜提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料：毛尖茶葉，采自都勻牛場；大豆，市售。

試劑：亞油酸(Sigma 生產，純度99.9%)；蘆丁，含量≥95.0%；Tween20；檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；硼酸緩沖液，其他化學試劑均為分析純。

儀器：旋轉蒸發器RZ-2000Z，鄭州英峪予華儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；pH-ZC 數字式酸度計，上海理達儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制作

將蘆丁標準樣品在溫度100℃下干燥直到蘆丁重量不再產生變化，用電子分析天平準確稱取樣品0.0200 g，先加適量無水甲醇，使蘆丁完全溶解，再加無水乙醇，定容到100 mL，得到的蘆丁標準溶液，質量濃度為0.20 mg/mL。

分別精密吸取五組不同體積的蘆丁標準溶液置于5 個25 mL 的容量瓶中，用30%乙醇溶液補充至12.5 mL，加入1 mL 5%的NaNO2搖勻放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5min 后，再加入10 mL 4%的NaOH 搖勻，用30%乙醇稀釋至刻度，10 min 后用紫外分光光度計在波長510 nm 處進行測定，以溶劑做空白參比。根據實驗數據得到蘆丁標準溶液的標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Figure 1 Standard curves of rutin

用最小二程法進行線性回歸得蘆丁溶液質量濃度C(mg/mL)與吸光度值A 關系曲線的回歸方程式為Y=10.87412C+0.0086，相關系數R2=0.9995。

1.2.2 黃酮類化合物的提取

將毛尖茶葉洗凈放入烘箱中在70℃的條件下烘干，用中草藥粉碎機粉碎，過20 目的分子篩（粉碎得越細越好）。稱取20 g 的茶葉粉末于500 mL 的圓底燒瓶中，按固液比為1∶20（g/mL）準確量取400 mL 石油醚與茶葉粉末混勻浸泡一段時間，將浸泡好的茶葉回流，趁熱將回流好的茶葉抽濾，將濾渣用400 mL 石油醚再浸泡回流，取濾渣用400 mL 的無水乙醇回流，將濾液在50℃的條件下旋轉蒸發，加入無水乙醇使黃酮類化合物完全溶解。將其分別用500 mL、250 mL的容量瓶定容為750 mL。

1.2.3 黃酮類化合物含量的測定

取1 mL 黃酮類化合物溶液置于25 mL 的容量瓶中，向容量瓶中加入10 mL 無水乙醇搖勻后，用30%乙醇溶液補充至12.5 mL，加入1 mL5%的NaNO2搖勻放置5 min 后，加入1 mL5%的Al(NO3)3放置5 min 后，再加入10 mL4%的NaOH 混勻，用30%的乙醇稀釋至刻度，10 min后用紫外可見光分光光度計在波長510 nm 處進行測定，以溶劑做空白參比。

1.2.4 大豆中脂氧合酶（LOX）的提取[7]

將大豆用蒸餾水洗凈，在低溫下（0~10)℃的條件下將大豆磨碎后再經石油醚多次浸提后得到脫脂大豆粉。稱取24.3 g 脫脂大豆粉為原料，料液比為1∶10（g/mL），加入去離子水并用1 mol/L 的鹽酸調pH 值至4.5，攪拌50 min，抽濾；向濾液中加入固體硫酸銨至40%飽和，將濾液用2000 r/min 的離心機低溫（4℃左右）離心20 min；取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的飽和度達到60%。再次離心20 min，將沉淀用pH9.0 的0.2 mol/L 的硼酸鹽緩沖液溶解，溶液即為大豆的粗酶液，放入冰箱冷藏備用。

1.2.5 大豆中脂氧合酶（LOX）的活性測定

底物的制備：先配制10 mL 硼酸鹽緩沖溶液，使其pH 值為9.0，濃度為0.2 mol/L，然后取Tween20 0.25 mL 分散在該緩沖溶液中，邊搖動溶液邊滴加亞油酸0.27 mL，充分搖勻，使它們混合均勻，再加入一定體積的濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液，邊加邊搖動，直到使整個溶液澄清，將溶液pH 值調到9.0，然后用上述硼酸鹽緩沖液稀釋定容到500 mL 作為底物備用。

取一只潔凈干燥的試管分別向試管中5.5 mL的pH 值9.0 的硼酸鹽緩沖液，100 μL 的底物，0.4 mL 酶液（已稀釋一定倍數），搖勻后立即將試管至于60℃(在該溫度下酶的活力和黃酮類化合物的抑制效果均比較明顯) 的水浴中恒溫2 min 時測反應液在234 nm 處吸光度。以溶劑做空白參比。重復做兩次平行實驗。根據公式X=1000×(A1-A0)/3（X:酶的活性；A1：5min 時測定的吸光度；A0：2min 時測定的吸光度；3：第二次測定時間-第一次測定的時間）計算酶的活性。

1.2.6 黃酮類化合物對大豆脂氧合酶的抑制率的測定

分別取體積為4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL 的黃酮類化合物于5 只潔凈干燥的試管中，將5 只試管分別重復1.2.5 的步驟測出反應液在234 nm 出的活性（將其中的緩沖液換為pH 值為9.0 的硼酸緩沖液）。按照抑制率計算公式：Y=(B0-B1)/B0×100%計算其抑制率。

2 實驗結果

2.1 黃酮類化合物的提取

實驗測得得黃酮類化合物在510 nm 處的吸光度為0.641，根據蘆丁標準曲線的回歸方程Y=10.87412C+0.0086，計算得都勻毛尖茶中黃酮類化合物的提取率為5.227%。

2.2 大豆中脂氧合酶的活性測定及黃酮類化合物對其的抑制率

實驗測得大豆脂氧合酶在60℃時酶的活力為37.165。根據公式Y=(B0-B1)/B0×100%分別計算得不同濃度的黃酮類化合物對大豆脂氧合酶的抑制率數據見圖2。黃酮類化合物對大豆脂氧合酶的抑制率隨其濃度的增加而增強。

圖2 黃酮類化合物對大豆脂氧合酶的抑制率Fig 2 The inhibition rate for soybean lipoxygenase of flavonoids

通過我們之前的研究，發現密蒙花中的黃酮類化合物對大豆脂氧合酶有一定的抑制作用[5]，已有研究發現矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素可能對黑豆LOX 有一定的抑制性[8]。本實驗發現毛尖茶葉總黃酮對大豆中的LOX 的也有一定的抑制作用。

3 結論

都勻牛場的毛尖茶葉中的黃酮類化合物的提取率為5.227%。黃酮類化合物對大豆脂氧合酶有一定的抑制作用，隨著黃酮類化合物濃度的增加，對脂氧合酶的抑制作用也隨之增強。通過此研究，可為尋找天然的LOX 抑制劑奠定了一定的理論基礎。