硅質鈍化材料與促生菌劑組合施用對水稻累積鎘效應研究

梁金明 ，李嘉琳，陳波華，李永濤，王進進*

1. 華南農業大學資源環境學院/中英環境科學研究中心，廣東 廣州 510642；2. 中山市農業科技推廣中心，廣東 中山 528400

鎘是一種自然界中普遍存在的、具有高致病性的元素（Kumpiene et al.，2008；Huang et al.，2016；Li et al.，2018）。特別在中國南方地區，由于分布了主要礦藏帶，礦產開發和冶煉造成了一些如“癌癥村”和“毒大米”等的嚴重后果（Li et al.，2018）。土壤中鎘的移動性較強，導致其容易通過食物鏈進入人體，增加人類腎臟功能障礙、骨折、高血壓甚至癌癥的發病機率（Satarug et al.，2003）。根據廣東省地質調查院調查發現，珠三角鎘元素在土壤中的地質背景值已遠超出國家規定的安全標準含量（竇磊等，2014）。降低鎘的生物有效性，減少作物鎘吸收，實現鎘污染農田土壤“邊生產邊修復”是當前土壤污染控制與修復領域的研究熱點之一（胡崢，2017）。

原位鈍化修復技術因具有簡便、高效及成本低等優勢而成為農田土壤重金屬污染修復極具前景的修復方法之一（胡崢，2017）。在眾多的鈍化材料及應用效果的研究中，硅質鈍化劑由于其良好的鈍化效果和環境友好性，得到了越來越多研究者的關注（Kumpiene et al.，2008；Bolan et al.，2014；Xu et al.，2017）。如陳展祥等（2018）利用硅質的凹凸棒石及其改性材料進行盆栽試驗，發現兩種材料均顯著降低了土壤浸提態Cd含量，使得生菜地上部分Cd含量降低了41.0%和56.5%。Yao et al.（2017）采用鐵硅材料（ISM）、合成沸石（SZ）以及堿性粘土礦物（AC）等3種硅質鈍化材料在酸性菜地土壤中進行修復應用，發現鐵硅材料（ISM）可極顯著降低上海青可食部位中的Cd含量。Mao et al.（2018）采用改性凹凸棒石進行吸附研究，結果表明該硅質材料對 Cd的最大吸附量達到 272.8 mg·g-1。課題組前期也以天然鉬礦和泥巖為原料，經改性后制備出兩種對重金屬Cd具有良好吸附能力的硅質材料，并在水體和土壤培養條件下取得了良好的應用效果（胡崢，2017；He et al.，2018）。

鈍化材料雖然取得了良好的研究效果，但鈍化反應一般不具備特異選擇性，在鈍化重金屬的同時，有部分土壤中的養分，特別是磷也同時被鈍化劑固定無法被植物吸收，可能對作物的產量造成削減、降低農產品品質。農業生產對磷的需求在全球范圍內呈現快速增加的趨勢，磷酸鹽物質是植物生長的主要肥料來源，也是化學固定土壤重金屬污染方式的重要鈍化劑（林鈺柵等，2016）。解磷微生物 Bacillus，Pseudomonas，Rhizobium，Aspergillus和Penicillium等，是一類典型的植物根際促生微生物，通過分泌氫離子、有機酸等可將多種難溶性磷酸鹽如磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷礦粉等進行溶解，從而釋放出大量的可溶性磷酸根（Rodríguez et al.，1999；Khan et al.，2007），被土壤和植物吸收利用。課題組前期研究中篩選出了一種具有解磷、產生長素（IAA）、耐受重金屬Cd的多功能芽孢桿菌B19具有較強的解磷作用，且以此為基礎制備的微生物菌劑在盆栽試驗應用中取得了良好的解磷和促生效果（蒲強，2017）。

污染農田修復與耕地質量提升是一項復雜的系統工程，如何實現鈍化重金屬的同時保障作物的正常生長，往往需要多種技術的合理集成（王進進等，2019）。本研究基于課題組前期研發的對Cd具有強鈍化能力的改性鉬礦、改性泥巖和兼具解磷、促生長作用的促生菌劑在田間試驗條件下進行合理的組合技術集成驗證試驗，旨在評估不同修復技術或集成技術對田間水稻生長及Cd累積效應，篩選出一種適用于華南地區Cd輕度污染土壤的安全利用技術模式，為污染農田的安全利用和區域農業的可持續發展提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗水稻地位于廣東省中山市大涌鎮，經緯度為 22°26′19″N，113°15′34″E。供試土壤的基礎理化性質指標見表 1。該試驗點土壤總鎘質量分數為(0.376±0.053) mg·kg-1，前期調查采集的水稻籽粒中的總鎘質量分數為(0.215±0.003) mg·kg-1，根據《全國土壤污染狀況評價技術規定》（環發[2008]39號）中關于土壤污染風險的規定，該試驗點屬于輕度污染風險等級。供試作物為水稻（Oryza sativa L.），品種為珍香絲苗。所有供試材料均為課題組前期研制的產品。其中供試改性鉬礦材料是以鉬尾砂和白云石為原料經改性后后制得（胡崢，2017），pH為12.05，有機質質量分數為 0.07 g·kg-1，氮為 82.85 mg·kg-1，磷為 0.38 g·kg-1，鉀為 0.11 g·kg-1，鎘為1.09 mg·kg-1；供試改性泥巖為一種泥質灰巖經鐵改性后制得，對環境中的Cd2+、Pb2+和Ni2+均具有較強的吸附能力（He et al.，2018），其基本理化性質為 pH 值 8.22，有機質質量分數為(2.56±0.2) g·kg-1，陽離子交換量(65.06±0.3) cmol·kg-1，鎘質量分數為(0.11±0.02) mg·kg-1，鉛為(32.8±1.68) mg·kg-1，黏土礦物相對含量：綠泥石35%，伊利石22%，伊利石/蒙脫石間層 43%，間層比 20%，全巖定量分析：粘土56%，石英30%，鉀長石3%，斜長石11%；供試促生菌劑為從鎘污染土壤中篩選出的一種具有高效解磷、產生長素、耐受重金屬鎘的多功能芽孢桿菌B19（保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號：CGMCC NO.12405）（蒲強，2017）。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Physic-chemical parameters of the experimental soil

1.2 田間試驗設計

本試驗于2018年3-7月在中山市大涌鎮某地水稻田進行。試驗區布置及各處理添加量見表 2。共設置6種不同的修復處理，每種處理設置3個重復，每個重復的小區面積為30 m2，采用隨機區組設計：CK，即常規施肥處理；S，即常規施肥+增施 3000 kg·hm-2改性鉬礦；M，即常規施肥+增施1500 kg·hm-2改性泥巖；B，即常規施肥+增施＞1016cfu·hm-2菌劑；S+B，即常規施肥+增施 3000 kg·hm-2改性鉬礦+增施＞1016cfu·hm-2菌劑；M+B，即常規施肥+增施 1500 kg·hm-2改性泥巖+增施＞1016cfu·hm-2菌劑。在水稻種植前，平整土地，將土壤鈍化劑均勻的撒在待修復土壤上，用機械或人工翻耕土壤使得土壤鈍化劑與土壤混合均勻，完成后根據土壤干濕狀況適當灌溉使土壤保持濕潤狀態，平衡1周左右。待土壤鈍化劑施入土壤平衡1-2 d以后，施入促生菌劑。提前準備好菌劑母液，施用當天用水稀釋至50 L左右，保證施入土壤的活性菌數量＞1016cfu·hm-2，用噴壺或以撒施的方式施入土壤中，同樣根據土壤干濕狀況適當灌溉使土壤保持濕潤狀態，平衡3-4 d。待土壤調理劑與促生菌劑施入土壤平衡后，按照當地常規模式進行水稻種植，田間管理延續當地日常管理模式。

表2 田間試驗各處理添加量Table 2 Designed experimental addition amount

1.3 樣品采集與測試

田間試驗樣品采集工作于2018年7月下旬進行，每個試驗小區采集 3-5株長勢均勻的水稻植株及對應的土壤樣品，樣品帶回實驗室后，水稻植株樣品洗凈后分成根系、莖葉和稻谷3部分，取出水稻稻谷洗凈、吸干水分，風干后脫殼取出籽粒，水稻植株各部位風干研磨后待測。土壤樣品自然風干后，研磨分別過2 mm和0.149 mm篩，用于土壤pH和重金屬Cd的測定。

水稻籽粒產量采用試驗小區全收全測的方式測定，按比例換算成每公頃產量。土壤pH值采用玻璃電極法（PHS-3C，China）測定（水土比為 1∶2.5）（Xu et al.，2018）。土壤有效磷含量采用 0.5 mol·L-1NaHNO3浸提后用紫外分光光度法進行測定（Wang et al.，2018）。土壤重金屬 Cd總量采用三酸（HNO3+HF+HClO4，體積比為 5∶5∶3）消解（李冬琴，2018），采用國家一級標樣（土壤樣GSS-16）進行質量控制。浸提態Cd采用0.01 mol·L-1CaCl2提取（Houba et al.，2000）。水稻植株中的Cd含量采用 HNO3+HClO4（4∶1）進行消解（李冬琴，2018）。所有樣品測試全程同步做試劑空白，土壤及籽粒Cd待測液采用石墨爐原子吸收分光光度計（ZEEnit 650P，Germany）進行測定。

1.4 數據分析

鎘在水稻體內的轉運系數（TF）：

式中，TFshoot/root為Cd從根系到莖葉中的遷移系數；TFgrain/shoot為Cd從莖葉到籽粒中的遷移系數；Cgrain為水稻籽粒中 Cd質量分數（mg·kg-1）；Cshoot為水稻莖葉中Cd質量分數（mg·kg-1）；Croot為水稻根系中Cd質量分數（mg·kg-1）。所有試驗數據為3次重復的平均值和標準誤差，試驗數據采用 Excel 2013及IBM SPSS Statistics 23軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 修復處理對土壤有效磷及水稻產量的影響

從各處理下土壤有效磷含量結果（圖 1A）可知，未添加促生菌劑的處理（S，M）下，土壤有效磷含量相比于對照無顯著差異（P＞0.05）；單獨添加促生菌劑或促生菌劑與改性泥巖組合處理下，土壤有效磷含量顯著高于對照處理（P＜0.05）；而改性鉬礦+促生菌劑處理下，土壤有效磷含量無顯著增加，這可能是因為改性鉬礦的高堿性（pH 12.05）抑制了微生物的生長，因此沒有表現出顯著的解磷效果。

從水稻籽粒產量的結果來看（圖1B），除改性鉬礦+促生菌劑處理與對照組產量一致外（變幅0.4%），所有修復處理均表現出一定的增產效果，增產幅度達到0.5%-8.8%，特別是添加了促生菌劑的處理（B，M+B），增產幅度在左右處理中是最高的。從土壤有效磷和籽粒產量的變化來看，二者具有高度的一致性，二者之間的相關方程為y=9.4372x+402.34，決定系數R2為0.9138。說明本研究采用的促生芽孢桿菌具有顯著的解磷和促生效果。

2.2 修復處理對土壤pH值的影響

從圖 2結果所示，對照組土壤 pH值為(6.37±0.04)，呈中性，經過修復處理后，土壤 pH值變化范圍在6.25-6.54之間。經單因素方差分析（ANOVA）結果表明，單獨施用改性泥巖處理后，土壤pH值相較于對照（常規施肥）處理上升了約0.17個單位，達到顯著差異水平（P＜0.05）；單獨施用促生菌劑或促生菌劑與改性鉬礦組合施用后，土壤pH值相較于對照處理下降了約0.12和0.09個單位，差異同樣達到顯著水平（P＜0.05）；而單獨施用改性鉬礦或改性泥巖與促生菌劑組合施用后，土壤pH值相較于對照無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 各修復措施處理下土壤有效磷質量分數（A）及水稻籽粒產量（B）Fig. 1 Soil available P concentration (A) and rice yield (B) under different treatments

圖2 各修復措施處理下土壤pH值Fig. 2 Soil pH values under different treatments

2.3 修復處理對土壤浸提態Cd及水稻各部位Cd累積的影響

本研究中單獨施用改性泥巖后，土壤浸提態Cd含量相較于對照下降了37.2%（圖3），差異達到顯著水平（P＜0.05）；單獨施用改性鉬礦后下降了12.8%，但與對照相比差異不顯著（P＞0.05）；其余處理條件下，土壤浸提態Cd含量下降幅度為5.2%-10.5%，與對照相比均未達到顯著水平（P＞0.05）。

不同修復措施對水稻根系、秸稈和籽粒中 Cd含量的影響如圖4所示。水稻各部位中Cd的分布在不同處理下存在顯著差異。從根系中Cd含量變化來看，單獨施用促生菌劑處理（B）下根系 Cd含量相比于對照分別下降了7.5%，但差異未達到顯著水平（P＞0.05），而所有還有鈍化措施的處理（S、M、S+B、M+B）下，水稻根系 Cd含量均顯著低于對照處理（P＜0.05），降低幅度為22.0%－38.1%，說明在本研究中采用的兩種硅質鈍化材料均能顯著抑制Cd從土壤向水稻根系的遷移。

圖3 各修復措施處理下土壤浸提態Cd分數Fig. 3 Soil extractable Cd concentration under different treatments

圖4 各修復處理下水稻各部位Cd質量分數Fig. 4 Cd concentrations in roots, straws and rice grains under different treatments

從莖葉中Cd含量的變化來看，單獨施用促生菌劑處理下莖葉中的Cd含量與對照組無顯著差異（P＞0.05），而含有改性鉬礦的兩個處理（S、S+B）與含有改性泥巖的兩個處理（M、M+B）對莖葉中Cd的累積出現了相反的作用效果，相比于對照組來說，S和 S+B處理顯著降低了莖葉中的 Cd含量（P＜0.05），而M和M+B處理卻顯著增加了秸稈中的Cd含量（P＜0.05），考慮到根系中的Cd含量在這4種處理下無顯著差異，說明改性鉬礦會抑制Cd從根系向地上部位的遷移，而改性泥巖會促進 Cd的轉移。

從籽粒中Cd含量的變化來看，對照組籽粒Cd含量達到了(0.355±0.018) mg·kg-1，均超過了 Cd的國家食品安全標準限量值（0.2 mg·kg-1），超標幅度為77.7%。所有修復處理均顯著降低了水稻籽粒中的Cd含量（P＜0.05），降幅達到了35.3%-65.0%，說明各個處理均具有顯著的降低水稻吸收Cd的效果，但不同處理的降低效果差異顯著（P＜0.05）。單獨施用促生菌劑處理后，籽粒Cd含量(0.230±0.068)mg·kg-1下降了35.3%，但仍超過了Cd的國家食品安全標準限量值；改性泥巖+促生菌劑處理后籽粒Cd含量降低了48.1%，而單獨施用改性鉬礦或改性泥巖處理，或者改性鉬礦+促生菌劑組合處理后，籽粒Cd含量的降幅均達到60.0%以上。

2.4 修復處理對水稻籽粒轉運系數TF的影響

不同修復措施對水稻籽粒轉運系數（Cd從根系到莖葉的轉運系數 TFshoot/root和從莖葉到籽粒的轉運系數TFgrain/shoot）的影響如圖5所示，由結果可知，相比于對照組，S和S+B處理降低了Cd從根系向莖葉的轉移，降幅為28.1%和68.6%，且在組合處理（S+B）下達到顯著水平（P＜0.05），而M和M+B處理顯著增加了Cd從根系向莖葉的轉移（P＜0.05），增幅為228.6%和190.9%。但是這4種處理下籽粒中的Cd含量差異不顯著（P＞0.05），且均顯著低于對照組處理（P＜0.05），綜合考慮各處理下Cd在水稻根系、莖葉以及籽粒中的分布情況及 TFshoot/root和 TFgrain/shoot的變化，說明本研究中采用的改性鉬礦和改性泥巖鈍化Cd在籽粒中累積效應的機理可能存在差異，改性鉬礦可能是通過抑制Cd從土壤向作物體內的遷移過程來達到降低Cd在籽粒中累積的效應，而改性泥巖可能是通過增加Cd在莖葉中的滯留、降低Cd從莖葉向籽粒中的遷移過程來實現這一效果。

圖5 各處理下水稻籽粒的轉運系數（TF）Fig. 5 Transfer factor (TF) of rice grain under different treatments

3 討論

本研究中采用的兩種硅質鈍化材料均為課題組前期研制，在之前的研究中表現出了良好的吸附鈍化Cd的效果（胡崢，2017；He et al.，2018），在本試驗中也取得了相似的結果，單獨施用時對土壤有效Cd的鈍化率分別達到12.8%和37.2%，對籽粒Cd含量的降低率分別達到65.0%和61.7%。其中改性鉬礦主要的成分為24%的CaO、13%的MgO、15%的SiO2，為硅酸鈣鎂類物質，呈堿性，其鈍化土壤Cd的可能機理主要有：（1）提高土壤pH值，特別是材料中含有豐富的CaO，施用后會顯著降低土壤的交換性酸和鋁，而堿性的環境有利用土壤中的 Cd向吸附態或結合態轉移（Madejon et al.，2009），且隨著pH值升高，硅酸鹽礦物材料與重金屬的吸附作用逐漸增強（Bradl，2004）；（2）該材料具有巨大的比表面積且提供了大量的可交換性Ca2+和Mg2+，可以與土壤中的Cd2+發生交換吸附從而使得 Cd離子被固定在材料表面；（3）通過離子交換釋放出的 Ca2+和 Mg2+會與 Cd2+競爭作物根系的吸收通道（Wu et al.，2016），從而減少作物對Cd的吸收；（4）材料中含有豐富的Si元素，而水稻作為一種喜硅作物，土壤和水稻體內的Si元素會抑制作物對Cd的吸收和轉運（Liang et al.，2007；Liu et al.，2013）。從本研究結果來看，改性鉬礦可能主要是通過降低土壤中的有效 Cd以及減少 Cd在水稻體內的轉運來達到降低籽粒吸收Cd的目的。

本研究中采用的改性泥巖材料為一種泥質灰巖經Fe改性后制得（He et al.，2018），在本研究中對土壤Cd表現出良好的鈍化效果。該材料同樣屬于硅酸鈣鎂類物質，所以對Cd的鈍化機理與硅質材料有諸多相似之處，根據其礦物組成（見1.1），改性泥巖施入到土壤中，其材料中的 Na+、Ca2+、Al3+等離子會與土壤中的Cd2+發生離子交換吸附作用（Atar et al.，2012；Wang et al.，2014；He et al.，2018）；此外，通過前期研究對吸附重金屬前后的改性泥巖礦物進行表征發現，Cd在改性泥巖的表面可能會形成CdO或CdCO3而降低其在土壤中的移動性（Mazón-Montijo et al.，2010）；而且，泥巖礦物經過Fe改性后，材料中的Fe會在土壤溶液中水解形成FeOOH（Song et al.，2009），羥基基團會被重金屬取代，通過共用氧原子的形式被吸附固定在改性材料表面。經過改性后的礦物往往會較大程度的增加其對重金屬的吸附能力，因此在本研究中，單獨施用改性泥巖對土壤浸提態Cd的鈍化效率在所有修復處理中最高，達到 37.2%，差異顯著（P＜0.05）。

本研究中采用改性鉬礦和改性泥巖均表現出顯著的鈍化土壤有效態Cd的效果（圖3），各處理下土壤浸提態Cd含量與水稻各部位Cd含量間的相關關系見表3，浸提態Cd含量與根系中的Cd含量呈現出極顯著相關關系（P＜0.01），說明各修復處理下鈍化顯著降低了Cd從土壤向水稻根系的遷移。浸提態Cd含量與莖葉以及籽粒中的Cd含量之間不存在顯著的相關關系（P＞0.05），結合Cd在水稻各部位的分布特征來看，改性鉬礦的作用機理主要是通過降低Cd從土壤向根系的遷移，而改性泥巖的作用機理處理降低Cd從土壤向根系的遷移外，還會通過增加Cd在莖葉中的滯留效應達到降低籽粒Cd累積的效果。

表3 土壤浸提態Cd含量與水稻各部位Cd含量間的相關關系Table 3 Correlation between extracted Cd and Cd concentration in different parts of rice plant

南方土壤中鐵鋁含量較高，土壤中的磷多以FePO4或AlPO4形式存在，而這是作物無法吸收利用的（Richardson，2001），而已報道的解磷菌大多具有較強的解 Ca3(PO4)2的能力（Oliveira et al.，2009；Yu et al.，2011）。課題組前期研究中篩選出了一種具有解磷、產IAA、耐受重金屬Cd的多功能芽孢桿菌B19具有較強的解FePO4或AlPO4的能力（蒲強，2017），在本研究中也得到了較好的驗證（圖1A），并表現出較好的促生效果（圖1B）。基于該菌株制備的促生菌劑呈酸性，施入到土壤中會引入酸性物質，從而降低了土壤的pH值，本研究中單獨施用促生菌劑的處理（B）顯著降低了土壤的 pH值，這可能也是導致該處理對浸提態 Cd的鈍化效果不顯著的主要原因。而促生菌劑在與兩種供試的堿性材料配合施用時，也表現出不一致的效果。在與改性鉬礦（S）配合施用時顯著降低了土壤的 pH值，而與改性泥巖（M）配合施用時維持了土壤pH值不變。此外，從這兩種組合處理的解磷能力和促生效果來看，S+B處理無顯著解磷和促生效果，而 M+B處理表現出了預期的結果。這可能是因為試驗中采用的改性鉬礦 pH值達到12.05，強堿性作用抑制了微生物在土壤中的定殖，而改性泥巖的pH值為8.22，未對微生物的定殖和生命活動產生顯著的影響。單獨施用促生菌劑的處理顯著地增加了Cd在水稻根系和秸稈中的累積，對籽粒中Cd的累積雖有顯著的降低效果，可能是因為促生作用導致的生物稀釋效應所致，但修復后仍超過了 Cd的國家食品安全標準限量值 0.2 mg·kg-1（GB 2762—2012），說明本研究中采用的促生菌劑處理對減少Cd在水稻體內累積的作用有限，且可能會通過促進作物生長而增加Cd在水稻體內累積的風險。

雖然土壤中的各種離子在鈍化材料表明存在競爭吸附作用，但是對于大多數鈍化材料而言，并不具備專一的選擇性，因此在土壤中應用時存在同步鈍化土壤養分的問題。本研究采用具有鈍化能力的改性鉬礦或改性泥巖與具有解磷促生能力的多功能菌劑進行技術集成，從結果上看，組合處理（S+B，M+B）均顯著地降低了Cd在水稻籽粒中的累積，并顯著降低了Cd在水稻體內的轉運系數，對Cd污染農田土壤具有良好的安全利用效果，綜合組合處理對土壤養分的活化和對水稻的促生效果，在本研究試驗用地上，具有弱堿性的改性泥巖與促生菌劑的技術集成是一種兼具促生和降低 Cd在水稻中累積效應的、適合于大面積推廣的安全利用技術模式。

4 結論

本研究中，單獨施用改性鉬礦、改性泥巖和促生菌劑以及兩種硅質鈍化材料與促生菌劑的組合處理均能顯著降低稻米中的 Cd含量，降幅達到35.3%-65.0%。綜合各處理對土壤養分的活化能力、對水稻的促生效果以及降低Cd累積的效應考慮，“改性泥巖+促生菌劑”組合技術是一種具促生和降低Cd在水稻中累積效應的、適合于大面積推廣的安全利用技術模式。