施肥措施對華北潮土區小麥-玉米輪作體系土壤微生物群落特征的影響

張婷，孔云, ，修偉明, *，李剛*，趙建寧，楊殿林，張貴龍，王麗麗

1. 農業農村部環境保護科研監測所/農業農村部產地環境質量重點實驗室/天津市農業環境與農產品安全重點實驗室/天津市農田生態與環境修復技術工程中心，天津300191；

2. 沈陽農業大學植物保護學院，遼寧 沈陽 110866

土壤微生物是土壤生物中最重要的組成部分，在土壤營養元素循環、土壤肥力形成和發展、生態環境改善、植物生長和土傳病害防治等許多方面產生正面或負面的相互作用（徐萬里等，2015；Mulvaney et al.，2009）。土壤微生物能夠靈敏地反映土壤生態環境的變化，已被廣泛用于指示土壤質量變化和探究不同土地利用方式對土壤特征的影響（Kevin et al.，2016）。土壤微生物對不同施肥措施的響應和反饋對于評價科學施肥具有十分重要的意義（林先貴等，2016）。

化肥與有機肥、秸稈配合施用是解決當前中國農業生產中化肥過度使用行之有效的方法，是調節土壤養分平衡，實現土地用養結合，提高土壤肥力的重要手段。秸稈富含有機物質和氮、磷、鉀等營養元素（王青霞等，2019），秸稈還田在土壤中的腐解過程會對土壤酶活性、土壤微生物群落產生一定的影響（Chen et al.，2017）。生物有機肥是一類兼具有機肥和微生物功效的肥料，含有多種營養成分和有利于提高土壤肥力、促進作物吸收和元素釋放等特定功能的微生物（王喜艷，2018）。秸稈還田的基礎上配施生物有機肥，在保證土壤肥力的同時促進秸稈腐熟，且短期內對土壤微生物群落以及土壤理化性質的影響顯著（公華銳等，2019）。已有研究表明，施肥可使農田土壤微生物群落結構和功能發生改變，在長期施肥的條件下顯著影響土壤微生物的豐度、多樣性和活性（Tamilselvi et al.，2015；Chinnadurai et al.，2014）。施用有機肥能顯著改變微生物的群落結構及多樣性，提高微生物的生物量和代謝活性（Berthrong et al.，2013）。秸稈還田配施有機肥或微生物有機肥能合理調節土壤水氮環境，顯著提高土壤微生物的數量與活性，有利于土壤生態環境的改善，其中秸稈還田配施微生物有機肥效果最為顯著（公華銳等，2019）。生物有機肥的施入改變了土壤微生物群落結構及其對各類碳源的利用，可提高微生物碳源利用率、物種多樣性和豐富度，與之相比，常規施肥下土壤微生物群落結構變化不顯著（孫薇等，2013）。因此，在自然生態系統和農業生態系統中土壤微生物經常被用作早期生態脅迫的敏感指標，也被用于監測土壤質量的變化（Kevin et al.，2016）。

華北平原是中國糧食主產區之一，其土壤肥力高低關系到小麥、玉米等糧食作物高產與否，因此如何提升土壤肥力增加糧食產量成為農業發展的重中之重（李芳等，2015）。目前，不同施肥措施和秸稈還田對土壤微生物的影響已有一些研究（Souza et al.，2015；劉振香等，2015；李秀英等，2005；朱海平等，2003），但對于潮土區輪作體系下采用生物有機肥、化肥和秸稈三者配合施用對土壤微生物群落影響的研究還相對較少。為了保持華北地區農田地力的可持續性，研究輪作體系下不同肥料配施對土壤肥力及微生物生態系統的潛在影響至關重要。因此，本研究以華北潮土區小麥-玉米輪作系統為研究對象，采用 Biolog-ECO技術測定土壤微生物群落代謝特征，通過明確不同施肥措施下的土壤微生物群落結構和活性差異，以期更好地調控農田生態系統，提升該地區土壤肥力。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地位于天津市寧河區試驗示范基地（117°71′E，39°48′N），屬溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫11.2 ℃，年均降水量642 mm，無霜期210 d。于 2015年開始設置生物有機肥、化肥和秸稈配施處理。供試土壤為鹽化潮土，是華北耕作區典型性和代表性的土壤類型，耕作方式為冬小麥-夏玉米輪作。試驗前供試土壤的基本理化性質為：pH 7.28，全氮 1.02 g·kg-1，全磷 0.80 g·kg-1，堿解氮 61.63 mg·kg-1，速效磷 79.90 mg·kg-1，有機質 17.85 g·kg-1（侯萌瑤，2017）。

1.2 試驗設計

試驗共設置5個施肥處理（表1），以T1（單施化肥）為對照，其他處理分別為：T2（50%氮肥與生物有機肥配施）、T3（常量化肥與生物有機肥配施）、T4（常量化肥與秸稈配施）和 T5（常量化肥－生物有機肥與秸稈配施）。每個處理3次重復，共15個小區，小區面積為15 m×24 m。試驗中使用的肥料為尿素（N，46%）、磷肥（P2O5，18%）、鉀肥（氧化鉀，30%）、復合肥（N，20%；P，21%；K，7%）、生物有機肥（NPK 總養分 8%，有機質含量20%，有效活菌密度≥0.2×108/g）（馕播王牌），江陰市聯業生物科技有限公司生產。在種植前進行玉米秸稈按比例粉碎還田，小麥秸稈全部還田，生物有機肥全部作為基肥施用，純氮量 60%化肥作為基肥施用，純氮量40%化肥在小麥苗期作為追肥施入。

1.3 土壤樣品采集

夏季小麥收割前（2017年6月中旬）在各處理樣地中采集土壤樣品，采樣時去除表層的枯枝落葉。采用S形采樣法，隨機選取12點采樣，每個處理重復3次，采集0-20 cm深度的土壤樣品。同一處理每一重復土壤充分混勻形成一個混合樣品，剔除石礫和植物殘體等雜質，裝入無菌封口袋置于冰盒中迅速帶回實驗室，放入4 ℃冰箱保存，并在7 d內進行Biolog-ECO微平板分析。其余部分土壤樣品風干后，用于土壤基本理化性質的測定。

表1 不同處理肥料施用量Table 1 The amount of fertilizer applied in different treatments

1.4 測定方法

1.4.1 土壤理化性質的測定

土壤pH值使用MP511型pH計測定，水土比2.5∶1；土壤有機質測定采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱氧化法測定；土壤速效磷測定采用碳酸氫鈉-鉬銻抗比色法；土壤全氮使用流動分析儀測定。具體步驟參照《土壤農化學分析》（鮑士旦，2000）。

1.4.2 土壤微生物功能多樣性測定

土壤微生物的生理代謝圖譜（Community Level Physiological Profiling，CLPP）使用Biolog-ECO微平板并結合 Biolog微生物自動分析儀（Biolog，Hayward，CA，USA）測定，具體步驟參見Garland et al.（1991）的測定方法并略有變動。

1.5 數據處理與分析

土壤微生物群落整體代謝活性采用平均顏色變化率（AWCD）表征，多樣性采用Shannon指數（H′）、Pielou均勻度指數（E）、Simpson指數（D）和 McIntosh指數（U）和豐富度指數（S）表征，計算公式如下：

式中，Ai為第i孔在590 nm處的吸光度值；A0為對照孔在590 nm處的吸光度值；Bi為第i孔在750 nm處的吸光度值；B0為對照孔在750 nm處的吸光度值；n為培養基碳源的種類數，本研究中 n值為31。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板相對吸光值總和的比值，即Pi=C(590-750)/∑C(590-750)。

式中，S為豐富度指數；H為Shannon多樣性指數。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比值。

式中，ni是第i孔的相對吸光值。

運用 Microsoft Excel 2010軟件進行數據整理；運用SPSS 17.0軟件進行One-way ANOVA的Duncan多重比較方法及Data Reduction工具進行差異顯著性分析（P＜0.05）和主成分分析（Principle component analysis，PCA）；采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤理化性質的影響

不同施肥方式對土壤化學性質的影響不同（表2）。T1與T5處理的土壤有機質、全氮、全磷和速效磷含量具有明顯差異（P＜0.05），且T5處理的相關數值均高于其他處理。T1處理的土壤pH值顯著高于T2與T5處理（P＜0.05）。T2與T3處理相比，化肥減量降低了土壤 pH、土壤有機質、全氮和全磷含量，提高了土壤速效磷的含量，這可能是化肥減量處理年限較短，土壤速效養分對施肥變化較敏感。由此說明，與單施化肥相比，化肥-生物有機肥與秸稈配施降低了土壤pH值，增加了土壤有機質、速效磷、全氮和全磷含量，提升了土壤肥力。

表2 不同施肥處理對土壤理化性質的影響Table 2 Effect of different fertilization treatments on soil physical and chemical characters

2.2 土壤微生物群落平均顏色變化率

平均顏色變化率（AWCD）表征土壤微生物群落對底物不同碳源利用強度的指標，反映了土壤微生物的代謝活性、微生物群落生理功能的多樣性（Zabinski et al.，1997）。培養開始后連續7 d每隔24 h測AWCD變化（圖1）。隨著培養時間的延長，土壤微生物對碳源的利用量也逐漸增加。培養24 h前AWCD增長率變化不明顯，而培養24 h后AWCD值呈現快速增長的趨勢（除T3外），此階段微生物代謝活性最高，對不同碳源的利用能力最強。培養120 h時各處理AWCD在0.72-0.94之間，其變化表現為 T5＞T4＞T2＞T1＞T3，顯著性分析表明，T5和T4的AWCD值顯著高于T3（P＜0.05），但其他各處理之間（除T3外）差異不明顯（P＞0.05）。T3處理AWCD低于T1和T2處理，但差異不顯著，說明化肥與生物有機肥配施時，氮肥減量施用有助于提高土壤微生物對碳源的利用率。從整體趨勢上看，配施秸稈的處理土壤微生物 AWCD值升高速率更快，表明化肥、生物有機肥和秸稈三者配施改善了土壤微生物群落的活性，有助于提高土壤微生物利用碳源的能力。

圖1 土壤微生物群落AWCD隨培養時間的變化Fig. 1 AWCD changes with incubation time of different treatments

表3 土壤微生物群落功能多樣性指數Table 3 Diversity indices for soil microbial communities

2.3 土壤微生物群落功能多樣性

為進一步明確施肥措施對土壤微生物群落的影響，本研究對培養120 h的數據進行土壤微生物群落功能多樣性分析。Pielou均勻度指數（E）和Simpson指數（D）在各處理之間差異不顯著（P＞0.05）（表3）。各施肥處理中T5的土壤微生物5種功能多樣性指數的值均最高，其Shannon指數（H′）顯著高于 T1 和 T3（P＜0.05），豐富度指數（S）顯著高于其他各處理（P＜0.05）。以上結果表明，化肥-生物有機肥與秸稈配施能夠提高土壤微生物的多樣性、均勻度和豐富度，有利于維持土壤微生物群落代謝活性和功能多樣性。

不同施肥處理下，土壤微生物群落功能多樣性對土壤化學性質的響應不同（表4）。土壤全氮和全磷的變化對各處理下的土壤微生物群落功能沒有顯著影響。Shannon指數（H′）和Simpson指數（D）與土壤pH呈顯著負相關性；豐富度指數（S）與土壤有機質含量呈顯著正相關性；Shannon指數（H′）與土壤速效磷呈顯著正相關性。表明土壤微生物群落的多樣性與豐富度受土壤pH、有機質、速效磷含量的影響較大，在一定程度上增加土壤有機質和速效磷含量有利于提升土壤微生物群落功能多樣性。

表4 土壤微生物群落功能多樣性指數與土壤化學指標的相關關系Table 4 Correlation between the diversity indices of soil microbial communities and chemical indexes

2.4 不同施肥處理土壤微生物碳源利用特征

土壤微生物對Biolog-ECO微平板上的6大類碳源利用特征受到微生物群落組成的影響（劉晶鑫等，2015）。不同施肥處理對各類碳源相對利用率最高的均是糖類，占總碳源利用率的 45.34%-47.74%；氨基酸類次之，占 18.08%-22.48%；對羧酸類、聚合物類、胺類和酚酸類的相對利用率較低，分別占 10.83%-17.21%、4.87%-14.35%、4.44%-6.29%和1.41%-3.79%（圖2）。土壤微生物對糖類、酚酸類和胺類的碳源相對利用率在各處理之間差異不顯著（P＞0.05）。T3處理土壤微生物對糖類、羧酸類、胺類和氨基酸類碳源的利用能力最高；T2處理土壤微生物對聚合物類碳源的利用能力較高；T4和T5處理土壤微生物對酚酸類碳源的利用能力最高。這表明施肥方式的變化改變了土壤微生物對碳源利用的偏好，從而改變了土壤微生物群落的代謝功能。

圖2 不同施肥處理土壤微生物對6類碳源的利用Fig. 2 Utilization on six groups of carbon sources by soil microbe under different fertilizations

2.5 不同施肥處理土壤微生物群落碳代謝的主成分分析

Biolog的主成分分析通過降維的方法，用少數新的相互無關的變量來表示原始數據中大部分的信息，降維后的主元向量空間中可以用點的位置直觀地反映出不同微生物群落的代謝特征，是反映土壤微生物群落結構特征的有效手段（馬艷等，2006）。本研究共提取了10個主成分，累計方差貢獻率達92.59%。由于第3-10主成分貢獻率均小于10%，所以只對第1主成分和第2主成分分析土壤微生物群落的代謝特征。位于同一象限的各處理在第1、2主成分得分值離散較小，沒有顯著性差異，說明這些處理的土壤微生物碳代謝功能群結構相似；位于不同象限的各處理在第 1、2主成分得分值差異較大，說明不同處理土壤微生物碳代謝功能群結構存在較大差異（趙蘭鳳等，2017）。T1、T3位于PC2正端，T4、T5位于PC1正端，表明T1與T3處理、T4與T5處理的土壤微生物對碳源的利用方式比較接近，且兩組處理之間土壤微生物碳源利用能力在PC軸上差異顯著（圖3）。在各處理受PC軸主要碳源的影響中，T5處理受PC1上的主要碳源影響較大，其他處理則同時受到PC1和PC2上主要碳源的影響?？梢?，不同施肥處理在PC軸上出現了明顯的分布差異，表現出土壤微生物群落的不穩定性，即不同施肥處理對微生物的碳源利用類型有顯著影響。

初始載荷因子反映主成分與碳源利用的相關系數，載荷因子越高，表示該碳源對主成分的影響越大（張瑞等，2013）。進一步分析 31種碳源在PC1、PC2上的載荷值可知（表5），以|r|＞0.6計，與第1主成分（PC1）具有較高相關性的碳源有9個，主要包括糖類（6個）、氨基酸類（2個）和聚合物類（1個），而與第2主成分（PC2）具有較高相關性的碳源有2個，主要包括糖類（1個）和胺類（1個）。

表5 不同碳源種類在PC1和PC2上的載荷值Table 5 Correlation analysis of different carbon source utilization with PC1 and PC2

綜上所述，在PC1上，T5處理土壤微生物對β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖、L-天門冬酰胺、L-蘇氨酸和吐溫80的利用能力較強。

3 討論

微生物群落在土壤中處在一個動態平衡的過程中，土壤理化因子的變化會影響土壤微生物群落的平衡，從而影響土壤微生物的活性及其生態功能，進而影響土壤肥力和環境質量（Garland et al.，1991）。有機物料大都含有豐富的微生物所需的碳源、氮源，土壤中加入有機物料能夠提高有機質含量及微生物群落多樣性（孔維棟等，2004）。從本研究結果來看，不同施肥處理下的土壤理化性質發生了顯著變化，總體趨勢為：化肥-生物有機肥和秸稈配施＞化肥-生物有機肥配施＞化肥-秸稈配施＞單施化肥，化肥-生物有機肥和秸稈配施處理的土壤有機質、全氮、速效磷和全磷養分含量明顯高于其他處理。與單施化肥相比，生物有機肥與秸稈配施降低了土壤pH值。相關性分析表明，土壤微生物群落的多樣性與豐富度受土壤 pH、有機質、速效磷含量的影響較大，在一定程度上增加土壤有機質和速效磷含量有利于提升土壤微生物群落功能多樣性。這可能是由于秸稈還田后，秸稈附近微生物大量繁殖，形成土壤微生物活動層，加速秸稈中有機態養分的釋放，從而提高土壤有機質含量（王應等，2007）。前人研究表明，配施有機肥能夠顯著提高土壤有機質、速效磷、速效鉀和堿解氮的含量，氮肥的施入會降低根際土壤的 pH值（張恩平等，2018）。秸稈還田后能有效提高土壤有機碳、全氮含量，改善土壤理化性狀（劉繼明等，2013）。因此在實際生產中，可通過合理增施有機肥或秸稈與化肥配施來改善土壤理化性質。

平均顏色變化率（AWCD）能夠反映不同施肥處理下土壤微生物利用碳源的能力，可以根據AWCD值的高低來判斷微生物利用碳源能力的強弱（Benizri et al.，2005）。本研究中，不同施肥處理的 AWCD隨土壤微生物的生長時期逐漸升高，說明隨著時間的延長土壤微生物對碳源的利用能力在不斷提高?；?生物有機肥與秸稈配施處理的AWCD值高于其他處理，表明增施秸稈或生物有機肥能顯著提高農田土壤微生物的碳源利用率。分析認為秸稈還田后降解或有機肥施用增加了土壤有機質含量，使土壤中可利用的碳源種類增多，改變了土壤微生物生境，提高了土壤微生物的繁殖能力，增強了土壤微生物群落的代謝功能。在玉米秸稈還田方式中，發現全量秸稈還田顯著增加了土壤微生物生物量，一年兩次秸稈還田使土壤微生物生物量增加，且小麥季土壤微生物生物量顯著高于玉米季（強學彩等，2004）。與低量有機肥相比，中、高量有機肥處理提高了稻田土壤微生物的碳源利用率和微生物群落功能多樣性，土壤微生物碳源利用的類型因不同施肥處理而產生差異（郝曉暉等，2010）。

不同施肥處理下土壤微生物群落在各指數之間的值均不相同，其中化肥-生物有機肥與秸稈配施處理的均勻度指數（E）、McIntosh指數（U）和豐富度指數（S）顯著高于其他處理，說明該施肥方式能夠提高土壤微生物群落功能多樣性。這可能是由于生物有機肥中各種功能菌能夠改變土壤微生物區系，在植物根系生態系統中形成優勢菌群，并且抑制其他有害微生物的繁殖（楊麗等，2017）。秸稈降解后的植物纖維使土壤的質地疏松，增加了土壤含氧量，加之配施生物有機肥使土壤形成了有利于微生物生存繁殖的環境，提高了土壤微生物的代謝強度。秸稈還田后經土壤微生物的礦化作用能夠釋放碳、氮、磷、鉀等營養元素，這些元素是土壤養分的重要補充（梁銀麗等，2001）。秸稈是土壤微生物利用的有效能源，秸稈中含有大量易分解的有機物質，容易被微生物利用，添加這類物質可以促進土壤微生物增殖（Mubarak et al.，2003）。土壤中細菌、放線菌和真菌數量隨有機-無機肥配施比例的增加而增加，而在單施無機復合肥下微生物數量增加不明顯，中量有機-無機肥配施較單純施中量無機肥可顯著提高微生物數量（王才斌等，2013）。本研究結果與邢鵬飛等（2016）研究結果一致，他們發現秸稈還田+腐熟劑+常規施肥及有機肥替代部分氮磷鉀肥顯著提高了土壤微生物物種豐富度指數和均勻度指數，增強了微生物代謝活性，提高了土壤微生物群落功能多樣性。

Biolog-ECO板含有31中碳源，根據其不同的官能團可分為6大類（Insam et al.，1997），其中糖類7種、羧酸類9種、氨基酸類6種、聚合物類4種、酚酸類3種、胺類2種。本研究中土壤微生物群落對糖類、羧酸類和氨基酸類碳源的利用率均明顯高于其他3種碳源，分別占總碳源相對利用率的45.34%-47.74%、10.83%-17.21%和 18.08%-22.48%。主成分分析進一步解釋了不同施肥處理下小麥-玉米輪作體系土壤微生物碳源利用之間的差異。主成分分析表明，不同施肥處理在PC軸上出現了較大分異，說明了微生物群落的不穩定性，不同施肥處理對微生物的碳源利用類型有顯著影響。對PC1貢獻較大的碳源主要是糖類，而對PC2貢獻較大的碳源主要是糖類和胺類。徐一蘭等（2017）認為施用有機肥和秸稈還田使微生物可以利用的碳源趨于穩定，促進偏好氨基酸類和單糖糖類物質為碳源的微生物群落發育，從而增加了有機-無機肥配施處理稻田土壤中利用氨基酸類和單糖糖類物質根際土壤微生物群落數量。

綜上所述，施肥處理會對土壤微生物群落多樣性產生不同程度的影響。本研究中常量化肥-生物有機肥與秸稈配施增強了微生物代謝活性，顯著提高了土壤微生物功能多樣性。本研究結果為華北地區小麥-玉米輪作體系下優化施肥方式、維持土壤微生態、改善土壤環境和提高土壤肥力提供一定的參考依據。常量化肥-生物有機肥與秸稈配施是否為最佳施肥方式，改變各種肥料配比能否達到更佳的效果，僅從土壤微生物的變化特征研究還遠遠不夠，有待進一步深入研究。

4 結論

（1）本試驗中土壤微生物對不同碳源的相對利用率隨不同施肥處理的變化而不同，常量化肥-生物有機肥與秸稈（氮肥200 kg·hm-2；生物有機肥3000 kg·hm-2；秸稈全量還田）配施有利于土壤微生物代謝活性，有助于提高土壤微生物群落碳源利用能力。

（2）本試驗中常量化肥-生物有機肥與秸稈（氮肥 200 kg·hm-2；生物有機肥 3000 kg·hm-2；秸稈全量還田）配施提高了土壤微生物的多樣性和豐富度，有利于維持土壤微生物群落代謝活性和功能多樣性。

（3）土壤微生物群落代謝特征隨施肥措施變化而發生改變，其中常量化肥與秸稈配施和常量化肥-生物有機肥與秸稈配施的土壤微生物群落代謝特征較為相似，而與其他處理間土壤微生物群落代謝特征顯著不同。