DNA甲基化在基因表達調控中的意義及研究進展

鐘焱　徐慧　彭鳳蘭

[摘要] DNA甲基化修飾作用是目前表觀遺傳學的研究熱點。其參與基因表達調控、基因沉默、DNA損傷修復以及癌癥發生等重要生物學過程，大多癌癥的致病過程、免疫系統疾病、阿爾茨海默病等疾病都涉及表觀遺傳學改變，基因的甲基化主要發生在富含GC堿基序列的CpG區域，基因在相應的甲基化轉移酶的作用下調控癌基因、致癌基因的表達和DNA的損傷修復等。本文結合最新研究進展綜述DNA甲基化在基因組中的基因表達調控中的意義及研究進展。

[關鍵詞] 啟動子;甲基化;基因表達調控

[中圖分類號] R34 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0033-04

[Abstract] DNA methylation modification is a hot research topic in epigenetics. Its involved in regulating gene expression， gene silencing， DNA damage repair， and cancer， and other important biological processes， most of the pathogenic process of cancer， immune system diseases， Alzheimer′s disease are involved in epigenetic changes， gene methylation is mainly in the areas rich in GC base sequence of the CpG， gene under the action of the corresponding methylation transferase regulate the expression of cancer gene， oncogene and DNA damage repair， etc. In this paper， the significance and research progress of DNA methylation in gene expression regulation in genome were reviewed.

[Key words] Promotor; Methylation; Gene expression regulation

表觀遺傳學指基因的核酸序列不發生改變的情況下基因的表達卻發生了可遺傳改變的現象，甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾作用，它可在不改變基因序列的前提下，對基因序列中的堿基進行甲基基團修飾，以此抑制或促進基因的表達而影響機體功能，是生物體內蛋白質和核酸的一種重要的修飾方式，與癌癥、衰老、免疫系統等多種疾病的發生發展密切關聯，是表觀遺傳學的熱點研究內容[1-2]。如結直腸癌細胞中有許多異常的甲基化基因，主要包括非啟動子區域的總體低甲基化和啟動子區域的高甲基化[3]，基因低水平甲基化或去甲基化可激活基因的表達，導致癌基因表達上調或細胞染色體空間結構不穩定;基因高水平甲基化則關閉或沉默某些基因的活性，使得抑癌基因表達下調或DNA損傷修復受抑制，進而影響細胞周期、細胞凋亡等功能。

1 DNA甲基化與基因表達

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程，可以發生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳動物的DNA甲基化主要發生在G/C含量豐富的5′-CpG-3′序列的C堿基上。人類的CpG以兩種形式存在，一種是分散于DNA序列中，另一種是CpG結構高度聚集的CpG島，在正常組織里，70%～90%散在的CpG是被甲基修飾的。

DNA甲基化通過甲基化堿基序列而影響核酸空間構象、穩定性及其與蛋白質相互作用方式等，起到調控基因表達的作用。一般情況下，基因啟動子CpG島甲基化與基因表達呈負相關，基因內部的甲基化與基因表達也存在著弱的負相關。哺乳動物細胞內主要包含5種類型的DNA甲基化酶（DNA methyl transferase，DNMT），分別是DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三種酶具有甲基轉移活性，分為持續性甲基轉移酶和從頭甲基轉移酶，前者主要是DNMT1，它能使DNA雙鏈其中的一條鏈完全甲基化，參與DNA復制過程中新合成鏈的甲基化;后者主要包括DNMT3A和DNMT3B，在早期哺乳動物胚胎中高表達，但在細胞分化過程中表達降低，主要甲基化人類基因中CpG序列，使其半甲基化，繼而全甲基化。有研究[4-6]認為從頭甲基轉移酶可能參與細胞生長分化調控，其中DNMT3A以自抑制的形式存在，且組蛋白H3尾部可促進及誘導其活性參與細胞的基因表達調控及細胞分化。

2 基因甲基化調節基因表達調控的方式及意義

2.1 甲基化啟動基因序列，導致基因沉默

啟動子是基因表達與否的“開關”，是基因表達過程中RNA聚合酶特異性識別并結合的部位，富含GC序列并組成很多CpG島，啟動子中的DNA甲基化通過招募參與基因阻遏的蛋白質后抑制轉錄因子與DNA的結合來調節基因表達，進而沉默或抑制基因表達，是甲基化抑制劑假定的治療靶點。眾多腫瘤的一個重要特征是對應癌基因的DNA啟動子局部低甲基化，抑癌基因啟動子高甲基化，異常的DNA甲基化可作為腫瘤診斷、分類和治療的重要分子標志物[7-8]。

2.1.1 甲基化啟動子中轉錄因子的結合體位點 ?啟動子中一般存在大量CpG島，這些島呈高度甲基化狀態，甲基化可改變啟動子在基因中的原始構型，進而干擾特異性轉錄因子與啟動子上的特異識別位點結合，進而影響下游基因的轉錄調控，影響腫瘤的發生發展。有學者分析發現多發性骨髓相關基因DAZAP2啟動子的CpG2島上存在許多轉錄因子結合體位點，通過生物素5′端標記AP-2、CREB、c-Rel非甲基化（甲基化）轉錄因子結合位點探針，提取KM3細胞核蛋白，進行凝膠阻滯實驗發現，甲基化結合位點中的胞嘧啶能夠抑制某些轉錄因子與其結合位點的結合，DAZAP2基因的高度甲基化使得轉錄因子結合大大降低，導致基因表達顯著下調[9]。

2.1.2 啟動子中的甲基化序列與其特異性蛋白結合 ?啟動子中的甲基化序列通過與細胞核內的甲基化CG序列結合蛋白特異性結合，間接導致轉錄因子不能與基因結合形成轉錄復合物，導致基因沉默或基因表達轉錄終止，去甲基化則導致基因表達上調。白細胞介素-10（IL-10）與宮頸腫瘤的癌變呈正相關，腫瘤相關巨噬細胞是IL-10的重要來源細胞之一，而轉錄因子特異性蛋白（Sp1）可結合IL-10基因啟動子上富含GC序列的順式作用元件，張琪[10]研究發現腫瘤相關巨噬細胞中IL-10基因啟動子區域去甲基化促使轉錄因子Sp1與其結合而促進IL-10的表達。

2.2 甲基化導致基因點突變

DNA甲基化引起基因突變的機制主要是DNA序列在甲基化酶的作用下促進C（胞嘧啶）和5mC脫氨，抑制U的修復，并且使堿基U→T改變，進而導致CpG序列的C→T突變。有研究[10-11]報道發現非小細胞肺癌老年患者支氣管肺泡灌洗液內P53基因突變導致患者視黃酸受體（RAR）-β基因的啟動子區域甲基化率提高，進而導致該基因表達沉默，促進腫瘤細胞的生長和增殖，而正常人中的RAR-β基因的甲基化水平較低。臨床研究認為大多單獨發生的泛發性膿皰型銀屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是由IL36RN基因的純和或復合突變引起的，北京協和醫院的學者[12]通過研究發現GPP患者單核細胞全基因組DNA呈現異常甲基化狀態，與正常個體比較，其甲基化程度升高的位點5921個，甲基化程度降低的位點407個，GPP患者外周血單核細胞中的PDCD1基因呈高度甲基化狀態，DCD1的mRNA表達水平顯著降低，且與甲基化水平呈負相關，進一步表明DNA甲基化導致的核苷酸序列改變可能是參與GPP發病的重要機制之一。

2.3 甲基化影響基因錯配修復

基因突變和基因啟動子區的高水平甲基化是導致在錯配修復基因表達缺陷的兩大主要原因。組蛋白的翻譯后修飾在DNA損傷信號應答和修復中發揮了重要功能，其修飾的異常往往會導致DNA修復應答通路的阻斷和異常，最終導致細胞凋亡或基因的不穩定性[13]。甲基化是組蛋白最常見的翻譯后修飾，H3K36甲基化（組蛋白H3第36位賴氨酸甲基化）在DNA雙鏈斷裂修復和錯配修復等損傷修復活動中也發揮重要調控作用，對于賴氨酸殘基的甲基化修飾包括單甲基化、二甲基化或三甲基化修飾。Li等[15]通過研究發現，H3K36me3直接與hMSH6的PWWP結構域結合，保證了體內招募錯配識別蛋白HMUTsα與染色質的結合，在細胞周期的G1和S早期，H3K36me3的大量表達保證了hMutSα在DNA復制過程中引入錯配修復前就富集在染色質上，而缺失H3K36甲基轉移酶SEDD2細胞則會出現微衛星不穩定性以及自發突變頻率上升的現象，提示人源細胞中H3K36me3修飾調控DNA損傷修復，且與癌癥的發生緊密相關。

3 DNA甲基化與癌癥

腫瘤是一種高度異質性的疾病，近十年來科學家們開始相信表觀遺傳學改變在癌癥中發揮重要作用，特別是DNA甲基化。甲基化是基因組DNA在轉錄水平上進行調控的一種自然修飾方式，參與基因表達調控，進而參與細胞的生長發育、逆境脅迫應答等過程。當基因體內的啟動子出現甲基基團損失而導致基因表達異常蛋白質，進而影響正常細胞的結構和功能，細胞變異并可能導致癌癥。

癌細胞與健康細胞在DNA甲基化的異同可以用于解釋基因的腫瘤特異性表達差異，還可以用于發現生物標志物幫助檢測腫瘤、預測癌癥，預測腫瘤患者的預后，為腫瘤患者制訂治療計劃，癌細胞基因甲基化研究可用于研發一些干擾癌細胞甲基化的靶向藥物來調節細胞的基因甲基化模式，從而將癌細胞調整為正確的甲基化模式，抑制腫瘤生長[16]。美國加州大學的張鹍教授就已創造高通量甲基化無創檢測技術，他們團隊利用癌癥標志物和組織特異性CpG甲基化模式的雙重信號來檢測和定位癌癥，可用于癌癥的早期篩查與溯源[17]。有學者[18]認為DNA甲基化是癌癥的起始階段，DNA甲基化水平的檢測以及這些甲基化之間的“親密程度”能判斷癌癥進程所處階段。基因甲基化是癌癥發生發展的一種警示性標識，對細胞的基因進行甲基化檢測、計數、繪圖等有助于醫生對癌癥進行診斷、甄別、預防及治療，也有助于理順疾病的發病機制。

4 DNA甲基化與其他疾病

大量研究[19-20]均發現異常的DNA甲基化在癌癥、心血管疾病、精神疾病、自身免疫系等多種疾病發生發展中具有重要角色。Shinagawa的研究團隊[21]通過焦磷酸測序發現早期認知障礙及阿爾茨海默病患者的NCAPH2/LMF2基因啟動子的甲基化水平上調，并認為這種甲基化可影響神經元細胞丟失進而對疾病產生影響。寧波大學的劉桂利[22]研究發現OPRK1、OPRM1基因甲基化修飾與老年癡呆癥關聯，并通過實驗發現這兩個基因在老年癡呆患者中均表現為高甲基化水平并且與疾病表型密切關聯。

細胞因子是一種由巨噬細胞、T細胞等免疫細胞產生的小分子多肽，具有細胞調節免疫應答、組織損傷修復、參與炎性反應、間接殺傷癌細胞等生物學作用，DNA甲基化水平的變化可導致細胞因子的表達異常，進而影響T細胞分化及反應性發生改變。DNA低甲基化可導致如CD70、CD28、CD11a/CD18等細胞因子的基因表達上調，激活自身反應性T細胞，進而促進B細胞分泌免疫球蛋白，引起系統性紅斑狼瘡的自身免疫紊亂。有學者[23]研究發現哮喘患者外周血中促進炎癥發生的細胞因子如γ-干擾素、IL-1β、腫瘤壞死因子α、IL-17A基因的啟動子區域的甲基化水平低于健康人群，而外周血抗炎性因子如IL-4、IL-10基因甲基化程度較正常增高，細胞因子基因上的DNA異常甲基化對細胞因子的轉錄及功能有重大影響，可導致免疫反應調節紊亂，影響哮喘病程的發生發展。

5 展望

甲基基團是人類基因的重要組分，DNA出錯并甲基缺失是導致癌癥發生的重要原因。DNA的甲基化與癌癥的發生發展過程密切相關，甲基化的檢測將來或可助力癌癥檢測、預測癌癥的復發等。甲基化不僅與癌癥密切相關，也與其它疾病密切相連，如人體衰老、肥胖、人體成癮性等[24-25]，DNA甲基化的模式因疾病不同而異，應與疾病的亞型、預后及藥物反應等臨床信息相對應，隨著對DNA甲基化研究的深入，基因甲基化檢測將會成為精準醫療的重要組成部分，幫助臨床醫生對患者基因進行個體化診斷和治療。

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（收稿日期：2018-10-29 ?本文編輯：封 ? 華）