Genistein對雌性大鼠卵巢顆粒細胞FSHR基因表達的影響

溫海霞　張亞楠

[摘要] 目的 觀察Genistein對雌性大鼠卵巢顆粒細胞卵泡刺激素受體（FSHR）基因表達的影響，及其與雌激素受體（ER）的關系。 方法 選取25～28日齡雌性大鼠，皮下注射孕馬血清促性腺激素，建立促卵泡發育模型，分離卵巢顆粒細胞進行培養，分別給予Genistein（0、0.1、1、5、10、100 μmol/L）及雌激素受體阻斷劑ICI 182，780（1 μmol/L）處理24 h后，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測芳香化酶基因上游調控因子FSHR mRNA的表達。 結果 與空白對照組比較，10 μmol/L Genistein組FSHR mRNA表達顯著增加（P < 0.05）。ICI 182，780（1 μmol/L）預處理細胞30 min后加入1和10 μmol/L Genistein，其FSHR mRNA表達分別較1和10 μmol/L Genistein組顯著下降（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 10 μmol/L的Genistein可上調雌性大鼠卵巢顆粒細胞中FSHR表達，且該作用可能是通過ER介導的。

[關鍵詞] Genistein;雌性大鼠;卵巢顆粒細胞;卵泡刺激素受體

[中圖分類號] R966 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0016-03

[Abstract] Objective To observe the effect of Genistein on the expression of follicle stimulating hormone receptor （FSHR） gene in ovarian granulosa cells of female rats and its relationship with estrogen receptor （ER）. Methods Female rats aged 25-28 days were subcutaneously injected with pregnant mare serum gonadotrophin to establish follicular development model. Ovarian granulosa cells were isolated and cultured. Genistein （0， 0.1， 1，5， 10， 100 μmol/L） and estrogen receptor blocker ICI 182，780 （1 μmol/L） were treated for 24 hours respectively. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression of FSHR mRNA， an upstream regulator of aromatase gene. Results Compared with the blank control group， the expression of FSHR mRNA was significantly increased in the 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）. After ICI 182，780 （1 μmol/L） pretreatment for 30 minutes， the expression of FSHR in ICI 182，780 pretreated cells with 1 and 10 μmol/L Genistein was significantly lower than that in the 1 and 10 μmol/L Genistein groups （P < 0.05 or P < 0.01） respectively. Conclusion 10 μmol/L of Genistein can up-regulate the expression of FSHR in ovarian granulosa cells of female rats， and this effect may be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Female rat; Ovarian granulosa cells; Follicle stimulating hormone receptor

Genistein（也稱染料木黃酮）是植物雌激素大豆異黃酮的主要活性成分，具有強抗氧化性和多重腫瘤抑制效應[1-3]，能雙向調節雌激素受體[4-6]。研究[7]發現，Genistein可通過性腺外途徑誘導芳香化酶基因（CYP19）轉錄，增加局部雌激素合成，對絕經期后雌激素來源可能有重要意義。在卵巢顆粒細胞，CYP19活性主要受卵泡刺激素（FSH）調節[8]，后者通過FSHR-AC-cAMP-PKA途徑，激活cAMP反應元件結合蛋白（CREB），進而始動芳香化酶基因轉錄[9-10]。前期研究[11]發現，一定劑量的Genistein可影響卵巢芳香化酶基因表達，但FSHR是否參與其中，作用是否通過雌激素受體介導，目前尚不清楚。

本研究采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR），初步探討Genistein對雌性大鼠卵巢中顆粒細胞FSHR基因表達的影響，并利用雌激素受體阻斷劑ICI 182，780進一步觀察Genistein上述作用與雌激素受體的關系，初步揭示Genistein對卵巢局部雌激素分泌功能影響的分子機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

25～28日齡健康雌性SD大鼠，體重60～80 g，由哈醫大附屬二院實驗動物中心提供。實驗動物的使用許可證號為（黑）2013-002。

1.2 主要儀器及試劑

PCR擴增儀（PTC-100型，美國MJ.Research）;GIS凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）。Genistein、17β-雌二醇（17β-E2）及ICI 182，780（美國Sigma）;Trizol（美國Invitrogen）;BcaBESTTM RNA PCR Kit（大連Takara）;引物（上海英駿生物公司合成）。

1.3 細胞培養

于實驗大鼠頸部皮下注射孕馬血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），48 h后急性斷頭處死，立刻剝離出雙側卵巢，小號針頭反復刺破卵泡并反復吹打，充分釋放出顆粒細胞，200 μm濾網去除多余殘渣后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，1100 r/min離心5 min，棄上清液。向細胞沉淀中加入2 mL新鮮配制的DMEM/F12培養液（含青、鏈霉素），混勻，調整細胞濃度至（3×105～5×105）/mL。將細胞懸液分裝至6孔培養板上，置于37℃的5%CO2培養箱中孵育。細胞培養48 h后，加入一定濃度Genistein、17β-E2及ICI 182，780處理。

1.4 細胞分組及處理

實驗共分9組：0 μmol/L Genistein組（空白對照組，A組）;10 nmol/L 17β-E2組（B組）;0.1 μmol/L Genistein組（C組）;1 μmol/L Genistein組（D組）;5 μmol/L Genistein組（E組）;10 μmol/L Genistein組（F組）;100 μmol/L Genistein組（G組）;1 μmol/L ICI預處理30 min后加1 μmol/L Genistein組（H組）;1 μmol/L ICI 182，780預處理30 min后加10 μmol/L Genistein組（I組）。上述因素繼續處理細胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。上述實驗共重復3次。

1.5 檢測指標及方法

采用RT-PCR法檢測FSHR基因mRNA表達。采用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄按BcaBESTTM RNA PCR Kit說明書操作。通過Gene Runner軟件設計引物，以β-actin作為內參。引物的序列和產物長度見表1。PCR反應的擴增條件為94℃預變性1 min，94℃變性4 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環次數為35次，72℃充分延伸10 min。產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統掃描后進行條帶灰度分析，以FSHR基因與β-actin灰度比值代表前者相對表達量。實驗重復3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS 11.5統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠卵巢中顆粒細胞FSHR mRNA的表達情況

RT-PCR電泳結果顯示，各組細胞均擴增出一條清晰的、大小約為481 bp的FSHR特異片段。見圖1。

2.2 Genistein對顆粒細胞FSHR mRNA表達的影響

掃描的條帶分析結果顯示，與空白對照（A組）比較，10 μmol/L Genistein組（F組）FSHR mRNA表達明顯增加（P < 0.05），10 nmol/L 17β-E2組（B組）FSHR mRNA表達降低（P < 0.05），100 μmol/L Genistein組（G組）FSHR mRNA表達也明顯降低（P < 0.01）。用ICI 182，780（1 μmol/L）預先處理細胞30 min后，分別加1 μmol/L Genistein（H組）和10 μmol/L Genistein（I組）繼續處理細胞24 h，發現H組FSHR mRNA表達較D組明顯降低（P < 0.05），I組FSHR mRNA表達較F組明顯降低（P < 0.01）。見圖2。

3 討論

近年研究證實，植物雌激素Genistein可增加女性卵巢癌細胞對常規性化療藥物的敏感性[10]，調節女性內分泌活動，改善圍絕經期綜合征臨床癥狀[12-14]。前期在體實驗[15-17]也發現，Genistein上調雌性衰老大鼠的ER-α表達，并促進雌激素生成關鍵酶芳香化酶基因表達，但具體的分子機制尚不十分清楚。

Genistein可調節男性生殖系統FSHR表達[18]，并且Genistein能通過激活PKC和p38而促使DNA結合FSHR下游因子CREB，并促進芳香化酶基因CYP轉錄[19-20]。本研究觀察了Genistein對雌性大鼠卵巢中顆粒細胞FSHR mRNA表達的影響，結果發現10 μmol/L Genistein作用細胞24 h，可增加FSHR mRNA的表達（P < 0.05），并且ER阻斷劑ICI 182，780可明顯抑制1 μmol/L和10 μmol/L Genistein對FSHR 基因表達的上調作用（P < 0.05或P < 0.01），提示Genistein對FSHR表達的這種促進作用可能與調節ER有關[21]。

Genistein對子宮內膜CYP19的啟動子Ⅰ的影響可能通過一種新型膜性ER（G蛋白偶聯雌激素受體，GPER）介導[22]。然而，GPER是否也介導了Genistein對卵巢CYP19及上游FSHR表達的影響，還有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-09-29 ?本文編輯：王 ? 蕾）