磷酸川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導的H9c2細胞肥大的影響及其機制的研究

李春紅　王婕　吳愛明　陳慧洋　張婷　馬喆　高永紅　婁利霞

[摘要] 目的 探討磷酸川芎嗪對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的H9c2細胞肥大的影響及可能機制。 方法 以AngⅡ誘導的H9c2細胞肥大為模型，將細胞隨機分為對照組、模型組、磷酸川芎嗪組、磷酸川芎嗪+NE-100組、NE-100組。采用羅丹明標記的鬼筆環肽染色，觀察細胞面積的變化;Fura-2 AM法測定細胞內Ca2+濃度變化;Western blot法檢測Sigma-1受體（Sig-1R）、三磷酸肌醇受體（IP3R）與鈣調神經磷酸酶（calcineurin，CaN）的蛋白表達水平。 結果 給予磷酸川芎嗪干預可以抑制AngⅡ誘導的細胞面積增加（P < 0.05），這種抑制作用可以被Sig-1R抑制劑NE-100阻斷（P < 0.05）;同時，磷酸川芎嗪干預可以抑制AngⅡ誘導的BNP mRNA表達水平的增高（P < 0.05）。AngⅡ孵育降低Sig-1R的蛋白表達水平（P < 0.05），磷酸川芎嗪有恢復Sig-1R蛋白表達水平的趨勢（P > 0.05）;磷酸川芎嗪干預可明顯降低AngⅡ誘導的IP3R蛋白水平的增加（P < 0.05），NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）;但磷酸川芎嗪干預對AngⅡ誘導的CaN蛋白表達水平的增加無明顯抑制作用（P > 0.05）。此外，磷酸川芎嗪可以抑制AngⅡ引起的H9c2細胞內Ca2+含量的增加，NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）。 結論 磷酸川芎嗪對心肌細胞肥大有抑制作用，其機制可能與其通過Sig-1R干預IP3R的表達，影響細胞內鈣平衡有關。

[關鍵詞] 心肌細胞肥大;磷酸川芎嗪;Sigma-1受體;鈣調節

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of ligustrazine phosphate （ligu） on hypertrophy of H9c2 cells induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） and its possible mechanism. Methods H9c2 cells hypertrophy induced by Ang Ⅱ was used as a model. The cells were randomly divided into control group， model group， ligustrazine phosphate group， ligustrazine phosphate + NE-100 group and NE-100 group. Rhodamine-Phalloidin staining was used to observe the changes of cell area; Fura-2 AM was used to determine the changes of intracellular Ca2+ concentration; Western blot was used to detect the expression of Sigma-1 receptor （Sig-1R）， calcineurin （CaN） and inositol 1， 4， 5-trisphosphate receptor （IP3R）. Results Ligustrazine phosphate could inhibit the increase of cell area induced by Ang Ⅱ （P < 0.05）， which could be blocked by NE-100， a Sig-1R inhibitor （P < 0.05）， and Ligustrazine phosphate could inhibit the increase of BNP mRNA level induced by Ang Ⅱ （P < 0.05）. Ang Ⅱ incubation decreased the expression level of Sig-1R protein （P < 0.05）， ligustrazine phosphate had a tendency to restore the expression level of Sig-1R protein （P > 0.05）; ligustrazine phosphate intervention could significantly reduce the increase of IP3R protein level induced by Ang II （P < 0.05）， NE-100 blocked the effect （P < 0.05）; but ligustrazine phosphate intervention had no effect on the increase of CaN induced by Ang Ⅱ （P > 0.05）. In addition， ligustrazine phosphate inhibited the increase of intracellular Ca2+ in H9c2 cells induced by Ang Ⅱ， which was blocked by NE-100 （P < 0.05）. Conclusion Ligustrazine phosphate inhibits cardiomyocyte hypertrophy by interfering with the expression of IP3R through Sig-1R and affecting intracellular calcium balance.

[Key words] Cardiomyocyte hypertrophy; Ligustrazine phosphate; Sigma-1 receptor; Calcium regulation

近年來，我國心力衰竭的患病率持續增加，病死率居高不下[1-3]，而臨床上對心力衰竭的治療并無大的突破。心肌肥大是啟動心力衰竭的病理過程及心力衰竭的重要促進因素。心肌肥大的早期，心室壁增厚、心肌收縮功能改善，為代償性過程。在持久病理性應激情況下，心肌肥大伴隨著間質纖維化、收縮功能失調以及基因表達、能量代謝和電生理特征的異常，最終導致了失代償性心力衰竭[4]。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統的主要活性成分，其在心肌肥大中發揮重要作用。抑制AngⅡ相關的心肌肥大對防治心力衰竭具有重要意義[5]。

中醫認為，氣虛血瘀為心力衰竭的基本證候[6]，因此益氣活血法作為中醫治療心力衰竭的主要治法，貫穿心力衰竭治療的始終。從益氣活血方的活血藥川芎中提取的主要活性成分川芎嗪，研究顯示具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等作用[7]。同時，體外實驗研究[8-9]表明，川芎嗪抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，并認為其機制可能與其保護線粒體結構和功能及抑制心肌細胞內NF-κB途徑有關。集中分布于線粒體相關內質網膜（mitochondrion-as-sociated ER membrane，MAM）的Sig-1R是內質網中主要的分子伴侶[10-11]，在心臟中有相對較高的表達[12-13]。研究[14]顯示，Sig-1R具有心肌細胞保護作用，能夠改善心臟肥大和心力衰竭。本研究旨在探討磷酸川芎嗪是否能通過干預Sig-1R信號通路抑制AngⅡ誘導的H9c2細胞肥大。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9c2心肌細胞系購自中國醫學科學院基礎醫學研究所國家實驗細胞資源共享服務平臺。DMEM、胎牛血清以及胰蛋白酶購自美國Gibco公司。AngⅡ（ANGT-003）購自中國杭州中肽生化有限公司，磷酸川芎嗪購自中國藥品生物制品檢定所，NE-100（SML6031）購自美國Sigma公司。Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒（K1622）購自美國Thermo公司，定量PCR試劑盒購自ABI公司，所用引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。羅丹明標記的鬼筆環肽染液（CA1610）購自北京索萊寶科技有限公司。Sig-1R一抗（15168-1-AP）與GAPDH一抗（10149-1-AP）購自美國Proteintech公司，β-actin一抗（ab8227）購自英國Abcam公司，IP3R一抗（11217）購自美國Santa Cruz公司，CaN一抗（2614S）購自美國CST公司。全蛋白提取試劑盒（KGP250）與BCA蛋白含量檢測試劑盒（KGP902）購自江蘇凱基技術生物有限公司。Fura-2AM試劑盒（S1052）購于上海碧云天生物技術有限公司。其他試劑為市售分析純試劑。

1.2 儀器

千分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司，JA1003N型）;4℃離心機（上海滬粵明科學儀器有限公司，TGL-16G）;Gene Quant紫外分光光度計（Phar-macia Biotech公司）;基因擴增儀GeneAmp PCR System 9700（美國ABI公司，Applied Biosystems）;實時熒光定量PCR儀Mx3000P（美國安捷倫科技公司）;激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司，FV1000）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及分組 ?大鼠H9c2心肌細胞系在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中置于37℃ CO2孵育箱培養。長至80%～90%時去上清，加入無血清的DMEM培養基，細胞分為5組：①對照組：常規培養;②模型組：AngⅡ孵育，濃度為1 μmol/L;③磷酸川芎嗪組：AngⅡ孵育濃度為1 μmol/L，磷酸川芎嗪濃度為100 μmol/L;④磷酸川芎嗪+NE-100組：AngⅡ孵育濃度為1 μmol/L，磷酸川芎嗪濃度為100 μmol/L，Sig-1R抑制劑NE-100濃度為10 μmol/L;⑤NE-100組：NE-100濃度為10 μmol/L。不同處理組細胞孵育48 h后進行檢測。

1.3.2 羅丹明標記的鬼筆環肽染色測定細胞面積 ?根據試劑說明書操作。不同組細胞去上清，37℃預熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細胞2次，4%甲醛溶液室溫固定10 min，PBS清洗細胞2次，每次10 min。0.5%Triton X-100溶液透化處理5 min，PBS清洗細胞3次，每次10 min。取配制好的100 nm的TRITC標記鬼筆環肽工作液，覆蓋住細胞，室溫避光孵育30 min，PBS清洗細胞3次，每次10 min。DAPI溶液（濃度：100 nmol/L）對細胞核進行復染約30 s，PBS清洗細胞3次，每次10 min。選擇TRITC激發/發射濾片（Ex/Em=540/570 nm）和DAPI激發/發射濾片（Ex/Em=364/454 nm），共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察。

1.3.3 RNA提取和RT-PCR ?細胞去上清，PBS洗3次，吸干所有液體，加Trizol裂解細胞。加氯仿室溫震蕩3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清加異丙醇冰上放置5 min后4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清加75%乙醇洗沉淀，4℃ 12 000 r/min離心5 min棄上清，室溫晾干，加入DEPC處理H2O冰上溶解，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA，在oligo（dT）15和M-MuLV反轉錄酶作用下反轉錄為cDNA。PCR反應體系為25 μL∶5 μL cDNA，5 μmol/L上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，H2O 5.5 μL。反應條件：94℃變性5 min，然后進行30次擴增反應：94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃延伸40 s，最后72℃延伸10 min。基因引物序列為：BNP上游引物5′-CAGAAGCTGCTGGAGCTGATA-3′，下游引物5′-TCCGGTCTATCTTCTGCCCA-3′;內參GAPDH上游引物5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物5′-TA-CTCAGCACCAGCATCACC-3′。

1.3.4 蛋白提取和Western blot檢測目標分子蛋白表達水平的變化 ?收集細胞于1.5 mL EP管中，PBS清洗2遍。每管細胞（106個）加100 μL裂解液，用超聲破碎儀裂解。4℃ 12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測蛋白定量。

配制10%聚丙烯酰胺凝膠。電泳至溴酚藍指示劑到達預制膠底部，停止電泳。蛋白轉膜至NC膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。一抗（GAPDH：1∶5000;β-actin：1∶5000;GAPDH：1∶5000;Sig-1R：1∶200;CaN：1∶200;IP3R：1∶500）4℃孵育過夜;TBST洗膜10 min，連續3次;二抗（1∶8000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，連續3次。ECL化學發光，凝膠成像儀進行掃膜成像，image J軟件進行圖像分析，分析蛋白灰度值，以GAPDH為內參。

1.3.5 Furu-2 AM法測定不同處理組H9c2細胞的Ca2+含量 ?大鼠H9c2心肌細胞系細胞經不同處理分組培養48 h后，依據試劑盒說明操作。用D-Hank′s溶液洗滌細胞3次，加入Fura-2AM工作液，37℃細胞培養箱孵育60 min。除去Fura-2AM工作液，用D-Hank′s溶液洗滌，并37℃培養箱孵育20～30 min，用酶標儀檢測吸光值。激發波長340 nm和380 nm，發射波長510 nm。以340 nm和380 nm下的吸光度比值作為細胞內Ca2+相對含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導的H9c2細胞面積的影響

不同處理組細胞孵育48 h后，采用羅丹明標記的鬼筆環肽染色，共聚焦顯微鏡檢測細胞面積的變化。結果發現，與對照組比較，模型組細胞面積顯著增加（P < 0.05）;給予磷酸川芎嗪干預后，與模型組比較，細胞面積顯著降低（P < 0.05）;加用Sig-1R抑制劑NE-100后，與磷酸川芎嗪組比較，細胞面積顯著增加（P < 0.05）。由結果可知，AngⅡ孵育可以增加細胞面積，給予磷酸川芎嗪干預可以抑制AngⅡ誘導的細胞面積的增加，同時這種抑制作用可以被NE-100阻斷。見圖1（封四）。

2.2 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導的H9c2細胞肥大中BNPmRNA表達的影響

大鼠H9c2心肌細胞系經不同處理分組培養48 h后，提取總RNA，然后進行反轉錄，經熒光定量PCR檢測目的基因的表達變化。結果發現AngⅡ孵育48 h后可以導致BNPmRNA表達顯著升高，磷酸川芎嗪能對此產生明顯的抑制作用（P < 0.05），給予NE-100可以部分阻斷這種抑制作用（P > 0.05）。見圖2。

與對照組比較，*P < 0.05;與模型組比較，#P < 0.05。BNP：腦鈉肽

圖2 ? H9c2不同處理組熒光定量PCR檢測BNPmRNA的表達（n = 4）

2.3 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導的H9c2細胞中各目的蛋白表達的影響

大鼠H9c2心肌細胞系經不同處理分組培養48 h后，提取總蛋白。進行免疫雜交，檢測目的蛋白表達水平變化。結果發現AngⅡ孵育降低Sig-1R的蛋白表達水平（P < 0.05），磷酸川芎嗪有恢復其表達的趨勢（P > 0.05）;鈣離子通道蛋白IP3R在AngⅡ誘導后表達增加，給予磷酸川芎嗪顯著抑制其表達的增加（P < 0.05），NE-100可以阻斷這種抑制作用（P < 0.05）;同時心肌細胞肥大標志性蛋白CaN在AngⅡ誘導后增高（P < 0.05），磷酸川芎嗪對CaN蛋白表達的抑制作用不明顯（P > 0.05）。見圖3。

2.4 Furu-2 AM法測定不同處理組H9c2細胞的Ca2+含量

大鼠H9c2心肌細胞系經不同處理分組培養48 h后，依據Furu-2 AM試劑盒說明操作，檢測細胞內Ca2+相對含量。結果發現，與對照組比較，模型組細胞Ca2+含量顯著增加（P < 0.05）;磷酸川芎嗪可以抑制AngⅡ誘導的H9c2細胞內Ca2+含量的增加，NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

在心臟中，持續的病理應激導致收縮期心肌細胞Ca2+增加[15]，產生病理性心肌細胞肥大。研究表明，Sig-1R是應激損傷時細胞內亞細胞器間信號調節的重要分子伴侶，是細胞維持存活體系的關鍵[16]。近年來研究證實，Sig-1R作為內質網重要的分子伴侶[10]，可通過調節細胞內的Ca2+轉運通路，改善心肌細胞功能障礙，從而抑制心肌肥大的發生發展[17]，促進細胞存活[18]。Sig-1R可介導快速Ca2+內流和細胞內Ca2+動員，使細胞內Ca2+增加[19]。內質網的Ca2+損失可以將Sig-1R從與GRP78的相互作用中釋放出來，使其與其他蛋白質產生相互作用[18]。Sig-1R通過IP3R調節細胞內Ca2+濃度，抑制細胞內Ca2+過載，減輕心肌肥大和功能障礙[17，20-21]。已有研究[22]發現，在心力衰竭的人心肌細胞中，IP3R表達增加，而IP3R介導的Ca2+釋放可部分通過CaN依賴性機制調節心臟肥大[23]。

我們的前期在體動物研究表明，益氣活血方藥可顯著改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心臟重構和心臟功能，其機制與調節心肌梗死后心肌組織Sig-1R及相關分子的表達有關[24]。故本研究以體外培養的H9c2心肌細胞為研究對象，應用AngⅡ刺激，建立細胞肥大模型，應用益氣活血方藥中有效成分川芎嗪干預，探討其對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大的保護作用及與Sig-1R相關的機制。結果表明，磷酸川芎嗪能減輕AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞肥大，抑制心肌肥厚分子標志物BNP的mRNA表達增加，而NE-100可部分阻斷其抑制作用。證實磷酸川芎嗪減輕AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞肥大的部分機制與磷酸川芎嗪增加了心肌細胞中Sig-1R的表達有關。其次，本研究證實，磷酸川芎嗪可以通過Sig-1R干預IP3R的表達影響細胞內鈣平衡，抑制心肌細胞肥大，這種保護作用可能與CaN依賴的信號通路密切相關。

總之，本研究利用AngⅡ誘導的H9c2細胞肥大模型，通過給予磷酸川芎嗪及NE-100，檢測細胞面積及細胞內Ca2+濃度變化，以及Sig-1R、IP3R和CaN蛋白的表達，證實磷酸川芎嗪對心肌細胞肥大的抑制作用，其機制可能與其通過Sig-1R干預IP3R的表達，影響細胞內鈣平衡有關。

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（收稿日期：2019-01-22 ?本文編輯：金 ? 虹）