miRNA及其相關SNP在非小細胞肺癌預后中作用的研究概況

楊海慧，支金華，吳靜蕊

（西安醫學高等專科學校，陜西西安 710309）

原發性肺癌是迄今為止惡性程度最高的腫瘤之一，其死亡率在世界上所有腫瘤中最高。在所有原發性肺癌中，主要類型是非小細胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的85%以上。與小細胞肺癌相比，非小細胞肺癌對化療相對不敏感，然而由于惡性腫瘤基因突變的異質性、多樣性以及極其復雜的分子機制，再加上各種外部因素的影響，如吸煙史、T分期、手術方法和淋巴結清掃等，患者的預后不容樂觀。因此本文就近幾年與NSCLC預后相關的miRNA及其SNP的作用機制和相關研究方法做了歸納總結，為NSCLC的深入研究提供了理論依據。

1 miRNA及其相關SNP的作用機制

1.1 miRNA的作用機制

MicroRNA（miRNA）是在植物、動物和某些病毒中發現的非編碼單鏈小分子RNA，含有19～25個核苷酸，其作用是RNA沉默和轉錄后對基因表達進行調控。在真核細胞中，miRNA首先轉錄成細胞核中的pri-miRNA，并在初始剪接后轉運到細胞質中進行最終修飾，成為19～25 nt的成熟miRNA，并且成熟的miRNA可作為基因的轉錄調節因子。隨著生物技術的發展進步和實驗方法的豐富，miRNA的作用也逐步被證實，它能夠通過其自身特異性結合位點識別并連接靶mRNA上3'端和5'端非翻譯區序列上的特異性識別區域，反過來引起識別的mRNA的翻譯抑制或降解，從而阻斷靶基因的翻譯和蛋白質的表達。人類約有1/3基因受到miRNA調控。

由于已經發現并證實了miRNA的作用，許多學術期刊都發表了關于miRNA的文章，研究人員密切關注它的發現和功能。目前，徐艷敏[1]、赫羽喆[2]等人均表示miRNA的研究主要集中在miRNA的發現和靶標的預測上，并且逐漸轉變為生物制藥和疾病控制方面的應用。由于miRNA與靶基因mRNA的結合位點通常位于靶mRNA的3'末端非翻譯區，因此有關miRNA作用機制的研究主要集中在靶基因mRNA 3'末端非翻譯區的miRNA和mRNA之間的相互作用。但 近 些 年 Orom UA，Place R F，Tay Y 等 開 始 了mRNA的5'UTR[3]、啟動子區[4]和編碼區[5]miRNA-mRNA相互作用的研究[6]。由于每個miRNA可識別多達20個靶基因轉錄的mRNA，即使miRNA轉錄本僅有22個堿基，僅占所有轉錄基因的1%～5%，但可以調節多達30%的功能基因的表達。近年來，越來越多的實驗結論說明miRNA可以調控很多的生物學功能，如細胞分化、細胞凋亡、細胞周期、腫瘤的形成、病毒的復制和細胞的死亡等[7]。腫瘤形成的根本原因是DNA損傷。其中，miRNA的遺傳變異是導致DNA修復缺陷最重要的原因，因此miRNA與癌癥的發生和發展密切相關。

隨著近年來科學技術的不斷發展，有關miRNA在腫瘤發生發展及誘導凋亡中的作用機制研究已經成為很多科學家關注的熱點[5]。miRNA有調節腫瘤的生物學特性，因此它既能作為腫瘤抑制基因，下調靶原癌基因的活性，它也可以作為腫瘤促進基因，下調靶腫瘤抑制基因的活性[8]。許多研究發現，特定腫瘤特異性miRNA水平的分析有助于腫瘤的早期診斷和預后評估[9]，為探索腫瘤侵襲、增殖和轉移機制，尋找早期診斷標志物和新的治療靶點研究提供了新的方向。

1.2 miRNA基因相關SNP的作用機制

隨著miRNA的發現、高通量測序技術的發展以及研究水平的深化，miRNA相關的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）逐漸成為與腫瘤等各種疾病密切相關的生物學標志物。SNP可能在人類基因組每幾百個堿基中引起一個突變，并且當miRNA結合位點SNP起作用時，便會影響miRNA-mRNA結合，從而導致疾病。因此，miRNASNP為各種疾病，特別是腫瘤的臨床治療提供了新的策略。

2 MiRNA-SNP和NSCLC

據文獻報道，miRNA及其相關的SNP有望成為NSCLC臨床治療和療效有效預后的預測指標，同時確定并證實了在肺癌及其他腫瘤中許多與發病風險、藥物療效、易感性評估、臨床結局預測等多個方面關聯的變異位點[10]。miRNA基因的SNP主要位于初級miRNA轉錄物（pri-miRNA）、miRNA前體（premiRNA）的莖-環結構區域，甚至是成熟miRNA序列中。miRNA基因的SNP主要通過影響miRNA的加工和/或影響miRNA-mRNA的相互作用來干擾miRNA的調控作用，與非小細胞肺癌患者的預后預測密切相關。NSCLC相關miRNA基因及其相關SNP的研究有利于解釋肺癌發生發展的機制，明確肺癌的致病機制，對肺癌的診斷、治療和提高患者的生存率具有重要意義。

3 檢測NSCLC預后效果的常用研究方法

3.1 臨床資料

選擇患有非小細胞肺癌的病人和未患病的健康人群作為不同樣本。定義非小細胞肺癌患者人群的標準:通過手術活檢診斷為NSCLC并且沒有肺癌家族史的患者。對照組納入標準為:經過CT、PET-CT等臨床檢查結果，肺部占位性病變外滲、無刺激性干咳、痰中不帶血或無血痰、無胸痛等相關癥狀，同一時期在醫院體檢的健康人群[11]。

3.2 NSCLC診斷與分期

通過開胸手術、纖維支氣管鏡檢查等方式獲取肺部組織，通過病理診斷證實，診斷為NSCLC。使用國際肺癌研究協會（IASLC）2009年第7版病理學標準進行NSCLC分期[12]。

3.3 樣品采集及處理

NSCLC組和對照組患者晚8點后禁食，空腹12 h以上，早晨肘部靜脈采血5 mL并提取DNA。

3.4 Taqman SNP基因分型

設計一對針對待檢測的靶SNP位點序列的PCR引物和Taqman探針。設計的兩個Taqman探針序列基本相同，除了SNP位點的堿基不同外，其他序列相同，5'末端用熒光基團標記，3'末端用淬滅基團標記。探針與模板DNA結合以覆蓋靶SNP位點，當探針完整時，淬滅基團可吸收熒光基團發出的熒光，在實時定量PCR擴增期間，探針與模板退火，然后Taq DNA聚合酶切除探針5'端的熒光分子。游離的熒光基團遠離淬滅集團后，脫離其抑制并發出熒光信號（參見圖1）。通過實時PCR儀記錄熒光顏色的變化，以確定SNP位點的特定基因型是純合的野生型、雜合型還是純合的突變型[13]。

圖1 Taqman探針法原理

3.5 基因型鑒定

通過SDS軟件Allelic Discrimination程序分析基因型，并檢測由相同基因的不同等位基因標記的熒光集團和淬滅集團的熒光強度，判斷待測樣本的基因型[14]。

3.6 樣本信息收集及臨床隨訪

收集患者基本資料，包括姓名、性別、年齡、地址、電話號碼、職業、婚姻狀況、教育程度等；個人情況，包括肺癌家族史、吸煙史、長期用藥史等。治療情況，包括住院時間、影像變現、手術信息、出院時療效、隨訪時間等。

患者出院3個月后接受第一次隨訪，專業人員電話咨詢患者出院后是否進行過復查，包括:影像學檢查、血清學檢查等；是否有復發及再次手術治療情況；是否重新接受過藥物、放化療、放療；是否存在長期并發癥以及患者的生存和死亡狀況以及死亡時間。隨訪間隔時間為3個月，周期為3年。

3.7 臨床預后分析方法

采用卡方檢驗和Fisher's檢驗分析患者的年齡、性別、吸煙史、病理類型、術后化療、生存狀態和復發狀態等有無差異。然后使用Cox比例風險回歸模型分析這些臨床指標對總體存活率（OS）和無復發存活率（RFS）的影響。計算存活死亡及復發風險率（HRs）、95%置信區間和P值。在Cox回歸分析中，使用諸如年齡、性別、吸煙史、病理類型和術后化學療法等臨床指標來相互校正。所有測試雙側P值小于0.05時才被判定為具有顯著性差異。使用Kaplan- Meier生存曲線和Log-rank檢驗（對數秩檢驗）來評估不同患者組之間的總體存活率和無復發存活率是否存在差異。

4 問題和展望

NSCLC具有惡性程度高、發病隱匿、早期不易發現，預后效果差、5年生存率低等特點。為找到有效的治療方案并改善預后狀況，腫瘤標記物已被廣泛應用于NSCLC的鑒定、治療效果的觀察和預后的監測中，此外，對腫瘤標記物的研究已從分子水平發展到基因水平。研究證實了NSCLC患者miRNA-SNP的異常表達，這與NSCLC患者的預后密切相關，已成為NSCLC預后的有效分子標記物。它為改善患者術后病情和降低復發死亡率提供了新的研究方向。但目前的研究還不夠深入，如何將目前的研究結果與臨床診治、科學用藥結合起來，為患者制定更個性化的治療方案，如何分析預后價值還有待進一步研究。