田螺MT基因的克隆與鑒定

劉靜，郭章，李景，沈宋利

（1.紹興文理學院，浙江紹興 312000；2.杭州伊美源檢測科技有限公司，浙江杭州 310030；3.浙江鼎清環境檢測技術有限公司，浙江杭州 310030；4.浙江聚光檢測技術服務有限公司，浙江杭州 310053）

MT(金屬硫蛋白基因，Metallothionein)是一種天然生物活性的物質，廣泛存在于生物體內，能被金屬離子、氧化損傷及免疫刺激等多種因素誘導產生，具有參與細胞內金屬水平的穩態調節、清除重金屬解毒自由基等重要生物學功能。

近年來，國內外學者對金屬蛋白進行了廣泛的研究，并已深入到基因水平。分子生物學技術的快速發展，使MT克隆技術、RNA印跡技術和PCR技術應用于MT的定量檢測成為現實。MT克隆檢測是通過MT多克隆和單克隆抗體，運用免疫擴散、免疫電泳等方法來對組織中的MT-mRNA含量進行定量分析，這在生物學研究中有重要的意義。然而目前還缺乏一種簡便、靈敏、快捷適宜產業化的分離純化和檢測技術，這也成為MT研究的熱點。

金屬硫蛋白一個顯著的特點就是能在轉錄水平上被環境中的金屬所誘導，外界環境穩定時，MT在動物體內的表達是穩定的，當外界或者體內金屬元素的含量超過一定濃度時，將誘導MT的表達，表達水平的高低與環境中的金屬濃度有直接的關系[1]。目前普遍認為，金屬硫蛋白主要的生理功能是穩態調節細胞內金屬水平，即參與生物體內必需金屬元素的調節和非必需金屬元素的解毒[2]。

1 材料

1.1 實驗動物

田螺，取自紹興文理學院實驗基地。

1.2 主要儀器設備

上海鼎科SW-CJ-1D垂直潔凈工作臺、美國賽洛捷克高速微量冷凍離心機D3024R、MASTER LOCK微型離心機Mini-6K、尚儀電熱恒溫鼓風干燥箱XGQ2000、icers藥品冷藏箱、上海博訊立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋BXM-30R、常州國華數顯恒溫水浴箱HH-8、上海嘉鵬全自動凝膠成像分析系統ZF-288、馳唐暗箱紫外分析儀WFH-203C、Eppendorf基因擴增儀 Mastercycler X50、上海天能穩壓穩流型電泳儀EPS200。

1.3 主要試劑及藥品

無水乙醇，糖原，1.5 mL Eppendorf管（RNase-free），Tips（RNase-free）[α-32P]dCTP（＞ 400 Ci/mmol），50 mmol/L、200 mmol/L EDTA，TE- 飽和酚∶氯仿（1 ∶ 1），7.5 mol/L NH4Ac，100%、70% 乙醇，TE緩沖液、蛋白胨、NaCl、氯仿、瓊脂、異戊醇等為國產分析純；pMD19T載體、DNA Marker購自Takara公司；dNTPs、rizol試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA抽提試劑盒購自碧云天公司；DH5α、氨芐、X-Gal、青霉素、IPTG、EB等。

2 實驗方法

2.1 準備工作

（1）塑料制品的處理。將DEPC加入裝有離子水的玻璃燒杯中，制備為濃度0.1%的DEPC溶液。將待處理的塑料制品放入高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液至塑料制品全部浸泡。通風室溫處理過夜。回收廢液，用錫箔紙封口或包裹塑料制品，滅菌，烘干備用。

（2）玻璃和金屬物品。用錫箔紙封口或包裹，250 ℃烘烤 3 h 以上。

（3）采取0.002 μmol/L氯化鑭刺激田螺，取經鑭刺激的鰓組織。

2.2 田螺RNA的提取

采用Trizol法提取田螺RNA。

（1）液氮研磨，將田螺鰓組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此3次，每50～100mg組織加入1ml Trizol，轉入離心管進行第（2）步操作；

（2）勻漿:組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿需 1 ～ 2 min；

（3）細胞或組織加Trizol后，室溫放置5 min，使其充分裂解。可放入-70 ℃長期保存；

（4）12 000 g 離心 5 min，棄沉淀；

（5）根據 Trizol的體積，每 1 mL Trizol中加入200 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。注:禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂；

（6）4℃ 12 000 g 離心 15 min；

（7）吸取上層水相，至另一離心管中。棄下層酚相；

（8）按每1 mL Trizol中加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫放置 5～ 10 min；

（9）4℃ 12 000g離心 10 min，棄上清，RNA 沉于管底；

（10）按75%乙醇∶Trizol=1∶1比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；

（11）4 ℃ 8 000 g 離心 5min，盡量棄上清；（12）室溫晾干或真空干燥5～10 min；

（13）可 用 50 μL H2O、TE buffer或 0.5%SDS溶解 RNA樣品，55～ 60 ℃，5～ 10 min。注:H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓；

（14）測O.D值定量RNA濃度。

2.3 MT基因克隆與鑒定

2.3.1 總RNA的檢測

取3 μL的RNA樣品和1 μL溴酚藍Buffer混合，用1.0%普通瓊脂糖凝膠電泳在100 V電壓下電泳10 min，電泳結果用凝膠成像系統觀察照相。

2.3.2 反轉錄

（1）滅菌離心管冰浴備用；

（2）將目的RNA和對照RNA冰浴融化；

（3）按順序依次加入RNA 2.0 μL、引物dT17 1.0 μL、DEPC 水 2.0 μL；

（4）混勻后，分別將離心管于70 ℃水浴中保溫5 min，再冰浴 5 min；

（5）在另一個離心管中依次加入DEPC 水 8.5 μL、5×RT Buffer 4.0 μL、dNTPs 1.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV RTase H 1.0 μL 試劑混勻并冰浴；

（6）將上述按每個反應15 μL準備的反應混合液，加入含5 μL先前配制的RNA模板和引物混合物的離心管中；

（7）模板和引物退火:將反應管置于25 ℃保溫5 min；

（8）cDNA鏈合成:將反應管置于42 ℃保溫1 h；（9）直接取用或冷凍保存。

2.3.3 PCR反應

將反轉錄得到的cDNA作為模板進行PCR擴增反應，基因的特異性引物為MTf:5’-ATGGCATCTCAAGTGTGTGC-3’；MTr:5’-CTATCACTCGAGGTCAGTGT-3’。

PCR 結束后 4 ℃保存，再取出近 8 μL PCR 擴增液擴增產物用2.0%普通瓊脂糖凝膠電泳在90 V電壓下電泳10 min，EB溶液染色15～20 min，電泳結果用凝膠成像系統觀察照相。

2.3.4 PCR產物的回收與克隆鑒定

（1）挑取大腸桿菌 DH5α 單菌落，接于 5 ml LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜；

（2）以1∶50比例將1 mL菌液轉移到新鮮LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養1.5～2 h；

（3）將4 mL培養液轉移到5 mL離心管中，4 ℃下，5000 rmp 離心 3 min；

（4）棄上清，加 0.5 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打或搖動以混勻細胞（勿劇烈振蕩）；

（5）冰浴15～20min，4℃，5000 rmp離心2min；

（6）棄上清，加 0.1 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞，即得感受態細胞；

（7）取0.1 mL感受態細胞轉移到1.5 mL離心管中，加 1 μL 質粒，混勻，冰上放置 30 min；

（8）42 ℃水浴 60 s，冰浴 2 min；加入 0.8 mL 新鮮 LB 培養基，37 ℃，180 r/min 振蕩約 1 h；

（9）取200 μL涂布到含有氨芐青霉素的平板上，37 ℃倒置培養 12 h。

2.3.5 測序鑒定

挑取陽性克隆，擴大培養后測序。所得測序結果提交GenBank比對，辨別是否為所需的田螺MT基因片段。

3 結果與分析

3.1 田螺的RNA提取

總RNA提取如圖1所示，說明RNA的完整性較好。

3.2 田螺MT的PCR擴增

對總RNA反轉錄所得到的cDNA進行PCR擴增，擴增出的條帶在250 bp左右，即目的基因所在條帶。結果見圖2。

圖2 MT的PCR擴增產物

3.3 MT基因的測序比對

經測序和提交Genbank比對，上述PCR擴增產物的序列均為MT序列，并且100%相同，表明分別從cDNA和DNA中擴增出了田螺的MT序列，兩者序列完成一致，證明田螺MT基因不含有內含子，因此鑭處理不影響MT基因的轉錄。

4 討論

MT是一類富含半胱氨酸和金屬離子的、具有基因多態性的小分子蛋白質，廣泛表達于所有真核細胞和部分原核細胞的胞漿中。在應激等條件下，MT也可以被釋放到細胞外來發揮作用[3]，具有廣泛的生物學功能，是科技界在動物體內發現的一種生理功能很多的活性物質。，由于MT分子中含有20個游離的巰基（-SH）基因以及由它們組成的多個巰基簇，因此在提高生物體的健康生長、增強抵抗力、增強免疫力等方面具有十分重要的作用。金屬硫蛋白具有很強的金屬結合能力和氧化還原能力，在生物體內參與細胞內金屬水平的穩態調節、自由基清除、重金屬解毒等，具有重要的生物學功能[4].因此MT基因的結構及表達的調控是目前生物醫學領域的一個研究熱點。

MT具有很大的開發潛力和無法估量的應用價值，隨著人們對MT研究的不斷深入，對MT作用機理的不斷探明，MT的應用也將越來越廣泛。MT功能獨特，近年來對MT的研究日益受到重視。不僅對MT的分子結構、性質、參與體內微量元素代謝、解除重金屬的毒性、清除體內自由基、抗氧化損傷、防止機體衰老、應激能力等生物學功能進行了闡述，并對MT與腫瘤和其他疾病的關系等方面的研究進行了綜述，并提出了MT研究中存在的問題及展望。MT作為模型系統，還可在基因工程和基因表達調控方面發揮巨大的效益，可從MT的代謝方面、生理機能上、結構上和在養殖業中的應用，挖掘出金屬硫蛋白在養殖方向上的應用前景。