重組人源化抗TNF-α單抗純度穩定性的研究

曾晶，陳小敏

（1.湘南學院基礎醫學院，湖南郴州 423000；2.深圳波頓香料有限公司，廣東深圳 518051）

單克隆抗體具有高特異性、高活性和低毒性等特點，從而使其在醫藥領域備受關注，并逐漸成為國內外藥物研發企業的研究熱點[1-2]。但單抗類藥物結構復雜且不穩定，尤其是在藥物收獲期間容易降解和失活[3]，這些降解不僅會降低抗體純度，還可能引發患者的免疫反應產生諸多安全問題。因此，如何減少單抗在生產過程中的降解以保證其純度的穩定是生物藥最終成功應用于臨床的關鍵[4-6]。

生物仿制藥的研發過程具有所有生物藥物的技術復雜性，因此工藝對產品質量的影響極大。若生物仿制藥產品質量與原研藥不一致[7]，或者在整個產品生產周期內出現質量問題，對生物仿制藥的研發將是毀滅性的打擊[8]。

在抗體收獲期間，最容易遇到的是純度降解問題，主要原因是收獲過程中離心等操作的機械剪切力會對抗體造成一定的損傷[9]，另一方面，細胞在大剪切力下會發生裂解從而釋放出大量的還原性酶使抗體的二硫鍵斷裂[10]，這不僅會影響抗體純度，而且對抗體臨床用藥的安全性和有效性也會產生極大的影響。

有研究顯示，在抗體收獲期間，向培養液中不間斷通氣能保護抗體的二硫鍵[11]，本實驗也證實通氣對抗體純度具有一定的保護作用，但持續通入空氣會導致抗體主峰減少和酸性峰增加。CuSO4作為一種氧化劑，它能使抗體中自由巰基量減少，也可以促使未成對的二硫鍵進一步結合[12]。EDTA-2Na作為一種金屬螯合劑，能夠有效地與金屬離子結合，由于多數核酸酶和部分蛋白酶的催化作用需要Mg2+存在，故常用作核酸酶、蛋白酶的抑制劑，從而抑制還原酶的還原作用。

單抗純度穩定性是單抗生產中的一個重要指標，也是各制藥商重點研究的內容。本實驗通過添加酶抑制劑或者抗還原劑的方式，使抗體在下罐過程中的純度更加穩定，對單抗藥物的生產具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

標準品為重組人源化抗TNF-α單抗，由本實驗室保存；細胞發酵液由本實驗室發酵制得；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、CuSO4均購于Sigma公司；高效毛細管電泳系統為Beckman公司的PA800 Plus。

1.2 方法

1.2.1 發酵液裂解

取400 mL發酵液置于-80 ℃冰箱中，待全部凍結以后，拿出至室溫緩慢解凍，如此反復3～5次，采用反復凍融的方式進行細胞裂解。

1.2.2 實驗樣品放置條件

待細胞裂解后，8 000 r/min 條件下離心 10 min，收集上清，并用0.2 μm的濾膜過濾除菌。另配制CuSO4、EDTA-2Na母液并過濾除菌。在超凈臺中將細胞裂解液的上清分裝至5個無菌瓶中，每瓶100 mL。一瓶作為對照，不添加任何物質；一瓶持續從底部通入流量為5 mL/min的無菌空氣；另兩瓶分別加入適量的EDTA-2Na、CuSO4母液，使其終濃度分別為 10 mmol/L EDTA-2Na 和 70 μmol/L CuSO4；另 取100 mL未裂解細胞的發酵液作為陰性對照。所有樣品均置于25 ℃條件下，分別于放置24 h和48 h時取樣進行Protein-A純化，并進行后續實驗。

1.2.3 Protein-A精細純化

Protein-A柱用pH為7.3的20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl平衡柱子，平衡體積為 15～ 20 mL；將上一步放置的實驗樣品上柱，體積為15～20 mL；用沖洗緩沖液 20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl上柱，直至基線平穩即可；再用pH 3.7的檸檬酸緩沖液進行洗脫，觀察A280值并進行純化后樣品的收集，待A280小于70時停止收集；最后用0.1 mol/L NaOH進行清洗。

1.2.4 非還原十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（CE-SDS）

用超純水將上述樣品稀釋至2 mg/mL，將25 μL樣品、50μL 2×SDS 樣品緩沖液、5μL 250 mmol/L碘乙酰胺加入離心管，最后加入超純水補至終體積為100 μL，渦旋混勻 20 s，70 ℃條件下水浴 4 min，取75 μL至上樣瓶進行上機分析。分離電壓為15 kV，毛細管溫度為（20±2）℃，樣品傳送帶溫度為（17±2）℃，檢測波長為214 nm。

2 結果與分析

2.1 裂解細胞

反復凍融多次后對細胞密度進行前后對比，結果如表2。

表2 凍融前后細胞密度活力

從表2可以看出，反復凍融后60%的細胞發生了裂解，該條件可模擬大部分細胞發生裂解使得內含物被釋放，進而提供單抗被還原的環境。

2.2 非還原CE-SDS

對非還原CE-SDS方法進行驗證，同一標準品重復檢測三次的結果見表3。

表3 標準品非還原CE-SDS檢測純度

IgG標準偏差為0.21%，且檢測結果均＞95%，表明該方法穩定，能作為該單抗純度的檢測方法。

對實驗組進行檢測，具體實驗數據見表4。

表4 實驗組非還原CE-SDS檢測純度

由未裂解組與對照組比較可知，細胞裂解后的內涵物被釋放出來會導致單抗的純度由96.34%以上降低至59.78%，說明純度降解模型構建是成功的。另外三組實驗結果均顯示該條件能夠在一定程度上抑制單抗純度的降低，但只有EDTA-2Na能夠完全抑制還原酶，使單抗純度能夠持續維持在正常水平，發揮了提高抗體穩定性的作用。

3 結論

本研究對單抗純度問題進行了探討，細胞裂解后釋放的還原酶能破壞抗體結構，從而導致抗體純度降低，而通過添加CuSO4和EDTA-2NA能有效降低還原酶對抗體純度的影響。

在發酵下罐的過程中，還有一系列的操作能防止抗體被破壞。例如，采用臺式離心的方式進行料液澄清以減少剪切力；添加還原酶抑制劑以抑制還原酶的作用；降低下罐料液的pH以降低相關酶的活性。在采用這些方式的同時，還需考慮此操作對電荷異質性、多聚體以及多糖的影響，以保證抗體的安全性和有效性。