厭氧氨氧化顆粒污泥的擴培及菌種鑒定

□文/劉 鵬 張軼凡 孫曉瑩 楊貝貝 聶英進

厭氧氨氧化（ANAMMOX）是指在厭氧或缺氧條件下，由一類浮霉菌門細菌以亞硝酸鹽為電子受體，以銨鹽為電子供體，反應生成氮氣及少量硝酸鹽的過程[1～3]。與傳統生物脫氮工藝相比，厭氧氨氧化具有不需投加有機碳源、減少60%以上的曝氣能耗、剩余污泥產量少等優點[4]。但是厭氧氨氧化菌生長速率僅為0.002 7 h-1，倍增時間長達10～12 d[5]對生長環境要求極其嚴苛，DO[6]、氨氮[7]、亞硝態氮[7]等因素均會影響菌的活性，制約了厭氧氨氧化技術在水處理中的應用；顆粒污泥具有生物組成多樣、沉降性能良好、抗水質波動能力強等特點，培養出含厭氧氨氧化菌的顆粒污泥，將有利于后續工藝研究和工程應用，尤其是對氨氮含量高，僅靠傳統生化處理難以實現達標排放的高濃度污水，如污泥厭氧消化后產生的厭氧消化沼液和垃圾轉運、焚燒和填埋過程中產生的垃圾滲濾液等[8]的處理。有研究[9]采用UASB 反應器對厭氧氨氧化顆粒污泥進行培養，試驗過程中發現得到的顆粒污泥密度低且容易流失；也有研究利用SBR反應器對厭氧氨氧化顆粒污泥進行培養，卻發現該方法有總氮去除負荷低于2.0 kg/(m3·d)的缺點[10～11]。

綜上所述，開發一種總氮去除負荷高、顆粒污泥生長穩定的擴培方法具有重要意義。

1 試驗思路

以厭氧氨氧化顆粒污泥作為接種污泥，在發酵罐中以SBR 方式操作，由配水來提供主營養成分及微量元素；根據顆粒污泥的脫氮效能，隨時調整進水中氨氮和亞硝態氮的濃度，逐漸提高體系的總氮負荷，使厭氧氨氧化顆粒污泥逐漸適應進水水質的變化，避免基質累積產生抑制作用；摸索出總氮去除負荷高，顆粒污泥增長穩定的擴培方法，為后續的工藝設計、中試及現場試驗提供基礎。通過對擴培后的顆粒污泥進行高通量測序，可以鑒定顆粒污泥中包含的菌種及其功能，確定厭氧氨氧化菌在顆粒污泥中所占的比例，證明該擴培方法的有效性。

2 材料與方法

2.1 接種污泥及配水組成

在天津某大學試驗室內，從6 L容積的UASB反應器中取出2 L 厭氧氨氧化顆粒污泥為接種污泥，污泥濃度為20 000 mg/L，取出時總氮負荷為15 kg/(m3·d)；接種后，顆粒物泥濃度為800 mg/L，因此在擴培初期需要降低總氮負荷，在顆粒污泥馴化及增長的過程中，根據出水水質和總氮去除效率，逐步提高總氮負荷。

擴培過程所消耗的化學試劑分為主營養成分和微量元素兩大類。其中，主營養成分選用的試劑為工業級，微量元素選擇分析純的試劑。除EDTA外，試劑中均不含有機成分，避免異養菌大量繁殖對厭氧氨氧化菌產生抑制作用，所有試劑均從天津闊希環?？萍加邢薰局苯淤徺I并按表1的濃度配制好后使用。

表1 主營養成分與微量元素濃縮液配方[12]

2.2 試驗裝置

擴培裝置為上海百侖生物科技有限公司生產的HC014 不銹鋼發酵罐。其有效容積為50 L，內徑0.65 m，高徑比2.63。見圖1。

圖1 厭氧氨氧化顆粒污泥擴培裝置

以SBR的方式進行操作，每個換水周期為24 h，排水前需靜置1 h，待顆粒污泥沉降后，排出上清液40 L，再進水到40 L 并加入微量元素濃縮液。將10 L 主營養成分母液用蠕動泵連續滴加23 h并不斷攪拌。發酵罐需密封并且避光，防止溶氧和光照對顆粒污泥的生長產生抑制。罐體自帶加熱及保溫裝置，可將水的溫度控制在（35±1）℃，pH控制在7.8～8.5，反應過程中需要觀察pH的變化并補加稀硫酸，厭氧氨氧化產生的氮氣接入到氣體流量計中（型號為LMF-1，購自天津闊希環保科技有限公司）。由于顆粒污泥不斷產生氮氣，水中的溶解氧（DO）逐漸被排出，DO 值降低到0，發酵罐中可穩定維持厭氧環境。

2.3 測試項目與分析方法

氨氮（NH4+-N）采用納氏試劑分光光度法測定，亞硝態氮（NO2—-N）采用 N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定，硝態氮（NO3—-N）采用酚二磺酸分光光度法測定，總氮（TN）采用過硫酸鉀氧化分光光度法測定，混合液懸浮固體濃度（MLSS）采用重量法進行測定[13]。總氮負荷（NLR）、總氮去除負荷（NRR）及TN去除率由文獻[14]中的公式計算得出。水的pH、溫度和DO由發酵罐自帶的電極進行測定。由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16 s RNA高通量測序，對厭氧氨氧化菌的含量進行測定并鑒定出顆粒污泥所包含的微生物。

3 結果與討論

運輸途中，厭氧氨氧化顆粒污泥的活性可能下降；因此，剛接種到發酵罐的顆粒污泥需要時間恢復活性并適應新環境。在擴培初期，先降低體系的總氮負荷，防止因厭氧氨氧化菌的活性下降導致進水中的基質累積，對菌的活性和生長產生抑制作用。由反應方程可知，厭氧氨氧化反應需保證進水中NO-2-N/NH+4-N的摩爾比在1.32∶1左右。

各測試項目隨時間的變化情況見圖2。

圖2 各測試項隨時間變化情況

啟動階段，NLR 由0.2 kg/（m3·d）逐漸提升到0.8 kg/（m3·d），此時進水NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為314、406 mg/L，NO-2-N/NH+4-N為1.29∶1；根據出水水質和TN 去除效率，判斷顆粒污泥的活性，從而調整進水水質（NH+4-N和NO-2-N的濃度）；該階段目的是使顆粒污泥恢復活性，適應擴培環境，共持續40 d左右；在啟動階段，NLR、NRR 和TN、NH+4-N 和NO-2-N 去除率，進出水水質均存在波動；NRR 與NLR 的變化趨勢一致；當NLR提高速度快時，出水中NH+4-N和NO-2-N的濃度也升高，NO-3-N 出現累積，此時的TN 去除率明顯降低，顆粒污泥的活性被抑制。需要及時排水，降低進水的NLR，讓顆粒污泥恢復活性，適應水質變化后再逐漸提高NLR，可將TN去除率恢復到80%以上。

經過40 d 的啟動及適應期后，顆粒污泥適應了環境，到擴培第80 d時，NLR已經提高到1.5 kg/(m3·d)，此時進水中NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為831、1 033 mg/L，NO-2-N/NH+4-N為1.24∶1；出水中NH+4-N、NO-2-N的濃度分別為 20、28 mg/L，NH+4-N 和NO-2-N 的去除率達90%以上；當出水中NO-3-N的濃度升高到254 mg/L時，NO-3-N/NH-N 為 0.30，接近 0.26 的理論值，TN 去除率仍達80%以上，證明顆粒污泥正在進行厭氧氨氧化且活性較高。第80 d 時，測得顆粒污泥的MLSS 為6 000 mg/L，與剛接種時MLSS為800 mg/L 相比，擴培效果明顯。需額外注明的是，第45 d 時，圖 2a、c、d 中出現的異常波動，是由pH控制誤差導致，糾正后未再現。

到 106 d 時，NLR 已升高至 3.5 kg/(m3·d)，進水中NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為1 597、2 038 mg/L，NO-2-N/NH+4-N 為 1.28：1；出水中NH+4-N 濃度為 7.1 mg/L，NO-2-N 的濃度為 15.4 mg/L，NO-3-N 濃度為 429 mg/L，NO-3-N/NH-N為0.27。顆粒污泥正在進行厭氧氨氧化反應，TN 去除率在80%以上，NO-3-N 是由反應生成，沒有抑制顆粒污泥的活性。體系的NRR 已經提高到3.38 kg/（m3·d），克服了采用SBR法擴培NRR難以達到2.0 kg/（m3·d）的缺點[10～11]。第106 d 時，測得顆粒污泥的 MLSS 為 11 300 mg/L，對比第 80 d 時的 6 000 mg/L，在26 d 內污泥濃度增加了5 300 mg/L。第100 d 時出現的NLR降低為停電導致的反應暫停，通電后擴培恢復正常。

從發酵罐中取出顆粒污泥進行觀察，其為紅色，顆粒直徑在0.2～1 cm 之間，形狀不規則。對顆粒污泥進行16 s RNA高通量測序，可以得到微生物的種類和含量，見圖3。

其中：Candidatus Kuenenia 菌為目前已經發現的10 種 Anammox 菌之一[15]，屬于浮霉菌門，是污水處理系統中常見的優勢厭氧氨氧化菌，其比例占到了整個顆粒污泥微生物數量的11%；顆粒污泥中還有19%的反硝化菌（Denitrotisoma）[15]，它與厭氧氨氧化菌共生，可提高TN去除效果，減輕反應過程中NO-N的累積對厭氧氨氧化菌的抑制作用；1%的氨氧化菌（AOB，Nitrosomonas）[15]可將NH4+-N 氧化為NO-N，但由于擴培是在厭氧條件下運行，所以氨氧化菌含量很小，NO-2-N是由配水提供；亞硝態氮氧化菌（NOB，Nitrospira）[15]在顆粒污泥中沒有檢出，說明在厭氧環境下，出水中的NO-3-N是由厭氧氨氧化反應生成；異養菌（Chloroflexi，數量約占顆粒污泥的23%）可去除體系中的有機成分（如進水中的EDTA 以及厭氧氨氧化菌等產生的細胞分泌物和胞外聚合物），避免其他異養菌大量繁殖，同時也有助于顆粒污泥的成形[15]。

圖3 厭氧氨氧化顆粒污泥的外觀及菌種鑒定

4 結論

1）以厭氧氨氧化顆粒污泥為接種物，以SBR 的操作方式在50 L 發酵罐中進行擴培試驗。通過監測進出水水質，根據TN去除效果調整進水中氨氮和亞硝態氮的濃度，可提高厭氧氨氧化顆粒污泥抗水質波動的能力，適應擴培體系并穩定生長。

2）在106 d 內，厭氧氨氧化顆粒污泥的濃度從接種時的800 mg/L 增長到11 300 mg/L，顆粒污泥呈現紅色，大小在0.2～1 cm 之間，總氮去除負荷達到3.38 kg/(m3·d)，TN去除率穩定在80%以上。

3）通過16 sRNA高通量測序，Candidatus Kuenenia菌在顆粒污泥中的數量比為11%，該菌為常見的厭氧氨氧化優勢菌之一。反硝化菌、異養菌和厭氧氨氧化菌共生，能夠增強顆粒污泥抗硝態氮和有機成分累積的能力，提升TN去除效果。

文中所述方法能夠穩定、高效的對厭氧氨氧化顆粒污泥進行擴培，克服了SBR反應器總氮去除負荷低的缺點，為厭氧氨氧化工藝開發和實際應用提供了基礎。