HPLC法測定補腎強身片中5種化學成分的含量

葉曉婭，李華麗，薛曉會

(平頂山市食品藥品檢驗所，河南 平頂山467000)

補腎強身[1]片收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十五冊，由淫羊藿、菟絲子、金櫻子、女貞子和狗脊(燙)5味中藥組成。2017年我單位中藥室承擔河南省此品種的藥品價格倒掛專項檢驗，涉及18個地市、36批樣品，基本上涵蓋了在河南市場上流通的廠家。在檢驗過程中發現的問題主要是有些廠家產品的性狀、鑒別與標準有一定差異，如產品性狀不僅含有標準上規定的灰至棕灰色，還有棕褐色、棕色等；針對金櫻子、女貞子的理化反應鑒別和淫羊藿苷的薄層色譜鑒別，結果所顯示的顏色也有差異，這給結果判定帶來了一定的困擾。另外由于標準只能定性，不能定量，對制劑檢查有一定的制約，不能全面反映制劑的質量。現有的文獻報道多是關于淫羊藿苷[2]、金絲桃苷[3]、原兒茶酸[4]的單一成分的含量測定，但中藥復方制劑采用單一成分含量控制略顯不足，還有研究采用UPLC法同時測定6種成分[4]，UPLC是近年來發展起來的新型液相色譜儀，有出峰時間短、分離效果好的特點，但較一般的液相色譜儀價格更為昂貴，色譜柱填料粒徑要求比較微小，易堵、造價高，還有壓力高對儀器的有些部件易產生損壞，而常規液相色譜儀使用更加普遍、經濟。因此，本研究采用HPLC法同時測定補腎強身片中5種藥材所含有的5個化學成分的含量，經方法學考察均符合規定，為本研究制劑質量分析建立了可行的控制方法，為進一步完善補腎強身片的質量標準提供了參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀；戴安VWD-3100紫外檢測器；Acclaim C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫為35℃；XS-105電子分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)。

1.2 對照品與藥品

待檢補腎強身片共涉及12個廠家，從每個廠家取樣一批，其中一個廠家有薄膜衣和糖衣片兩種制劑規格，共計13個樣品。因有的廠家樣品含量不佳，故對廠家名稱不予公布，僅以代號表示。對照品原兒茶酸(批號110809-201205)、綠原酸(批號110753-201817)、金絲桃苷(批號11121-201708)、特女貞苷(批號110126-201605)及淫羊藿苷(批號110737-200415)均購自中國食品藥品檢定研究院，含量分別為99.9%、96.8%、95.1%、93.3%和100%。

1.3 試劑

乙腈(Merck)為色譜純；水為哇哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性實驗

采用Acclaim C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相。線性梯度洗脫：95%B(0 min)，85%B(8 min)，85%B(18 min)，72%B(30 min)，65%B(38 min)，55%B(45 min)，95%B(45.1 min)，95%B(58 min)；檢測波長(0～11 min)260 nm、(11～16 min)330 nm、(16～28 min)360 nm、(28～34 min)224 nm、(34～58 min)270 nm；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，HPLC色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷，對照品質量分別為15.82、11.22、10.84、11.74、10.87 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液(分別含原兒茶酸0.1564 mg·mL-1、綠原酸0.108 6 mg·mL-1、金絲桃苷0.103 1 mg·mL-1、特女貞苷0.109 5 mg·mL-1、淫羊藿苷0.102 4 mg·mL-1)；取混合對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品內容物1.0 g，精密稱定重量，置50 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇水約40 mL，超聲處理30 min，放冷，用70%乙醇水定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，經0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

注：1. 原兒茶酸；2. 綠原酸；3. 金絲桃苷；4.特女貞苷；5.淫羊藿苷

2.3 標準曲線的制備

精密吸取混合對照品溶液0.5、1、5、10 μL及混合對照品儲備液5、8、10 μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，并以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標進行回歸計算，結果表明各化學成分在相應濃度范圍內線性關系良好，見表1。

表1 五種化學成分線性關系和線性范圍

2.4 精密度實驗

取補腎強身片(批號：15121821)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，測定，以相應色譜峰的峰面積計算RSD，結果原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷的RSD(n=6)分別為0.72%、0.42%、0.51%、0.21%、0.29%，表明所用方法的精密度良好。

2.5 重復性實驗

取補腎強身片(批號：15121821)，按照2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各6份，進樣測定，結果原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷平均含量(n=6)分別為0.332 mg·g-1、0.561 mg·g-1、0.733 mg·g-1、1.29 mg·g-1、1.20 mg·g-1，RSD分別為0.32%、0.94%、0.51%、0.28%、 0.37%，表明所用方法的重復性良好。

2.6 加樣回收率實驗

取同一批號(15121821)樣品適量，研細，取1.0g，共6份，精密稱定。分別精密加入混合對照品溶液3 mL，按照“2.2.1”項下方法制備所需溶液，在上述色譜條件下測定，計算回收率。結果原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷的平均回收率(n=6)分別為103.1%、96.7%、97.0%、101.9%、98.2%，RSD分別為1.3%、2.5%、0.8%、1.0%、1.6%。

2.7 樣品的測定

取13個樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積，按外標法計算。結果見表2。

表2 12個廠家13批樣品中原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷的含量 (mg·g-1)

注：當S/N≤3時，結果為“未檢出”。

3 結論

本研究用HPLC法同時測定補腎強身片中原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、特女貞苷和淫羊藿苷的含量，可基本全面反映制劑質量，方法簡單，結果準確可靠，可用于本研究制劑的質量控制。

4 討論

本次試驗樣本有限，結果差異較大，這與藥材的產地、品種、等級或制劑工藝和輔料的不同等各方面因素有關，亦可能因為質量標準中缺少量的控制，企業未按規定的處方量投料，僅僅按照部頒標準的檢驗項目有區別投料，或對投料的藥材未進行有效控制，例如在2015年我所檢驗的紅花注射液專項，這個標準未更新前沒有“羥基紅花黃色素A”的含量測定，我們按照新標準測定了在標準更新前生產的這個成分的含量，有少部分是不達標的，但是執行新標準后，這個成分的含量測定全部測定達標(僅針對我所樣品)，因此中藥制劑質量標準提高對藥品質量的監控是一項非常重要的任務，另外結合中藥材原料的監管和中藥生產廠家的飛行檢查，可從根本上保障中藥制劑的質量。