氣相色譜內標法測定五福心腦清軟膠囊中冰片含量

楊曉玲，郝 福，侯金才*

(1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.京津冀聯創藥物研究(北京)有限公司，北京100083)

五福心腦清軟膠囊是以傳統活血化瘀中藥紅花的果實中提取的精制紅花油為主藥，輔以芳香開竅的冰片及維生素E、維生素B6組成的以中藥為主的中西藥復合制劑，具有活血散瘀、通經止痛、開竅醒神之功效。臨床用于瘀血阻滯所致的中風、中經絡、半身不遂、口眼歪斜、胸痹心痛、腦梗死、冠心病、心絞痛及高血脂癥見上述證候者[1-4]。收載于國家藥品中藥標準(經絡肢體 腦系分冊)，原標準只有冰片鑒別，本研究建立氣相色譜法[5]測定五福心腦清軟膠囊中冰片含量，并根據ICH等相關指導原則進行了方法學驗證，結果該方法專屬、精密、準確，可以作為五福心腦清軟膠囊的質量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PE Clarus580氣相色譜儀(鉑金埃爾默)，DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm；安捷倫)；MS-105DU型分析天平(梅特勒)；

1.2 試藥

五福心腦清軟膠囊(神威藥業集團有限公司，批號為16090731、16090732、16090733)；龍腦對照品(食品藥品檢定研究院，批號110881-201508)；內標物：水楊酸甲酯(中國食品藥品檢定研究院，批號110707-201413)；異龍腦對照品(南通飛宇生物公司，批號FY-GA01)；冰片原料(四川青神康華制藥有限公司，批號160308)；試劑：無水乙醇(色譜純，天津賽孚瑞)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)；載氣為氮氣；流速為1.5 mL·min-1；進樣口溫度為250 ℃；分流比10：1；起始柱溫為130 ℃，保持11 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至220 ℃，保持30 min；采用FID檢測器，溫度為250 ℃；氫氣流量45 mL·min-1，空氣流量450 mL·min-1；進樣體積為1 μL。

2.2 標準溶液制備

2.2.1 內標溶液 取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL約含7.5 mg的溶液，作為內標溶液。

2.2.2 對照品溶液 取龍腦對照品10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，精密加入內標溶液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為100%對照品溶液，保持內標溶液加入量不變，依法配制80%、120%對照品溶液[6]。

2.2.3 供試品溶液 取五福心腦清適量，傾出內容物，混勻，取約2.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，精密加入內標溶液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照儲備液 取精制紅花油38 g，維生素E 1.64 g與維生素B62.0 g置同一密封容器中，超聲混合均勻，備用。

2.2.5 異龍腦定位溶液 取異龍腦對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為異龍腦定位溶液。

2.2.6 冰片原料溶液 取冰片原料約100 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為冰片原料溶液。

2.3 方法學驗證[7-11]

2.3.1 系統適用性試驗 在上述色譜條件下，精密吸取3個濃度的對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，每個濃度平行進樣2次。結果平均校正因子為0.68，RSD=0.68%，系統適用性良好。

2.3.2 專屬性試驗 1倍陰性對照溶液：取陰性對照儲備液約2.48 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，充分搖勻，即得；3倍陰性對照溶液：取陰性對照儲備液約7.44 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，充分搖勻，即得；內標溶液：按“2.2.1”制備方法操作；對照品溶液：按“2.2.2”100%濃度制備方法操作；異龍腦溶液：按“2.2.5” 制備方法操作；冰片原料溶液：按“2.2.6” 制備方法操作；供試品溶液：按“2.2.3” 制備方法操作。精密吸取上述溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜，結果見圖1。

圖1 專屬性試驗圖譜

續圖1 專屬性試驗圖譜

由圖譜信息可知，在龍腦與水楊酸甲酯內標色譜峰位置處，不含冰片的陰性對照均無色譜峰出現。由此表明其他物質對測定無干擾，該方法專屬性良好。

2.3.3 線性與范圍試驗 ①取龍腦對照品40 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為200%龍腦儲備液；②取水楊酸甲酯120 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內標儲備液；③線性溶液的配制：分別精密量取200%對照品儲備液5、8、15 mL分別置于3個20 mL量瓶中，分別精密加入內標儲備液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻，作為50%、80%、150%的線性溶液，分別精密量取200%對照品儲備液5、6 mL分別置于2個10 mL量瓶中，分別精密加入內標儲備液1 mL，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻，作為100%、120%的線性溶液。

精密吸取上述線性溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。以龍腦對照品的濃度為橫坐標(x)，以龍腦對照品的峰面積與內標物的峰面積之比為縱坐標(y)，進行線性回歸分析，得回歸方程為：y=2.515 9x-0.009 5(r=0.999 9)，結果表明在0.19～0.58 mg· mL-1范圍內有良好線性關系。

2.3.4 溶液穩定性試驗 將對照品溶液與供試品溶液分別于0、4、8、12、18、24 h，精密吸取各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。每個時間點與0小時的測定結果相比，相對平均偏差均<3.0%，表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 精密度試驗 甲乙兩人分別各自配制6份供試品溶液在不同時間進行測定，結果12份供試品溶液RSD=0.64%(n=12)，精密度良好。

2.3.6 準確度試驗 ①50%濃度溶液：取龍腦對照品10 mg，精密稱定，與陰性對照儲備液約4.96 g置同一50 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，精密加入內標溶液4 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為50%濃度水平溶液；②100%濃度溶液：取龍腦對照品10 mg，精密稱定，與陰性對照儲備液約2.48 g置同一25 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，精密加入內標溶液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為100%濃度水平溶液；③150%濃度溶液：取龍腦對照品15 mg，精密稱定，與陰性對照儲備液約2.48 g置同一25 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，精密加入內標溶液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為150%濃度水平溶液。每個濃度水平平行配制3份。

精密吸取上述50%、100%、150%濃度溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。平均回收率為97.44%，RSD=0.64%，結果表明，本方法具有良好的回收率，結果見表1。

表1 回收率結果

2.3.7 耐用性試驗 通過改變載氣流速±0.1 mL/min，初始溫度±5 ℃。結果表明，色譜條件作微小變動，測定結果基本不受影響，保持一致，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

按“2.2.3”方法制備3批供試品溶液后，進行測定，用內標法計算，結果見表2。

表2 樣品分析結果

3 討論

3.1 冰片含量測定依據

根據國內復方中藥的質量標準制定指導原則[12]，處方中如果含有揮發性成分，如冰片、樟腦、揮發油時，應對易揮發性成分進行含量測定，規定含量范圍。控制易揮發性成分的含量，有利于控制制劑質量，保證制劑的療效。

冰片對照品是人工合成的，由龍腦和異龍腦組成。在本試驗條件下，五福心腦清軟膠囊的色譜峰中冰片也是兩個峰，通過比較保留時間，可以確定為龍腦和異龍腦，因此該藥中冰片為合成冰片[13-14]，最終我們建立了本品種冰片含量測定方法，以龍腦成分來計。

3.2 樣品溶劑確定

統計藥典[15]收載冰片測定品種所用溶劑，有環己烷、三氯甲烷、石油醚、無水乙醇、乙酸乙酯等，不統一。基于綠色環保檢測方法的考慮，我們選擇用無水乙醇作為溶劑。從測定結果可以看出，無水乙醇可以完全溶解五福心腦清軟膠囊內容物，準確性良好。

3.3 內標物選擇

經相關藥典[15]品種的查閱發現，測定冰片方法均為氣相色譜法，采用的定量方法基本為內標法。一般而言，內標法可以避免系統帶來的誤差，相對外標法更為準確，所以本品冰片的檢測方法定為內標法。

內標物的合適性尤其關鍵，內標物選擇的一般原則：內標物應與待測物分子結構相近，在色譜圖中內標物在待測物附近出峰；樣品中不存在內標物，且內標物與待測物分離完全；內標物應是純物質；內標物與樣品互溶，且不發生化學反應[16]。

在色譜圖中水楊酸甲酯在龍腦附近出峰；通過專屬性試驗可知，樣品中不存在內標物，且水楊酸甲酯與龍腦分離完全；水楊酸甲酯穩定，標準品易得；水楊酸甲酯與樣品互溶。水楊酸甲酯作為內標物，穩定性較好，不受其他因素的影響，校正因子結果均維持在精確的范圍內(0.68±0.01)，所以選擇其為內標物結果準確可靠。

3.4 色譜方法確定

①色譜柱選擇：統計藥典[15]收載冰片測定品種發現，色譜柱為毛細管色譜柱，類型均為聚乙二醇20000(PEG-20M)，我們最終選擇了DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)，該色譜柱具有高效性，分離效果好。②柱溫的選擇[17]：冰片中含有龍腦和異龍腦兩種同分異構體成分，二者性質相似，本實驗以龍腦為特征峰，對洗脫條件進行了優化(加入了升溫程序)，結果在最佳色譜條件下，既保證了龍腦峰與異龍腦峰有較好的分離度，又保證龍腦和內標峰有較好的峰型和適宜的保留時間，排除了復方中其他成分及基質對于冰片中龍腦含量測定結果的干擾，最終采用程序升溫法。

綜上所述，本試驗中采用氣相色譜法測定五福心腦清軟膠囊中冰片含量，經方法學研究顯示，該方法專屬、準確，可用于本品含量測定，為該藥品提供了有效的質量控制方法。