RP-HPLC法測定烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸含量

孫 全，吳文輝，徐 沖，劉 霞，楊 敏，冷 靜

(重慶市中醫院 藥劑科，重慶 400021)

烏梅具有斂肺止咳、澀腸止瀉、生津止渴、安蛔止痛的功效，常用于肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱消渴、蛔厥嘔吐、腹痛、虛熱消渴等癥。烏梅有烏梅肉、醋烏梅、烏梅炭等炮制品[1]。醋制法為烏梅最早的炮制方法，首載于漢代《金匱玉函經》，現代理論認為，醋制烏梅有增強收斂固澀作用，對肺虛久咳、兼有胃酸不足者尤為適宜。烏梅炒炭長于收斂止血，可以使血液蛋白凝固，血管收縮[2]。也有觀點認為烏梅炒炭的作用來源于炭的吸附以及有機酸。烏梅的主要物質基礎為有機酸類，枸櫞酸在烏梅中的含量較高。藥理研究證明，烏梅水煎液具有較強和較廣的抗菌[3-6]、抗氧化[7-8]、鎮靜催眠[9]、對小鼠潰瘍性結腸炎有一定的治療作用[10]。烏梅是否去核使用存在爭議，有人認為烏梅去核耗時耗力，不應去核。有人認為烏梅核有機酸含量較低，所占比重大，應該去核使用。烏梅不同炮制品以及不同部位中枸櫞酸的含量測定還未見文獻報道，本文測定了烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量，該方法簡便、準確，為烏梅的質量控制及臨床應用提供了依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，XA205DU型十萬分之一天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司)，烏梅(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：D1506073)，枸櫞酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111679-200401)，AS10200AT型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 方法與結果

1.2.1 烏梅不同炮制品的制備 取烏梅藥材，分離果肉與果核部分，得到烏梅肉與烏梅核樣品。取烏梅藥材100 g，加入米醋200 mL，浸泡12 h，干燥。分離果肉與果核部分，得到醋烏梅、醋烏梅肉、醋烏梅核樣品。取烏梅肉，預熱炒藥鍋至100 ℃時投入烏梅肉100 g，并待鍋溫升至235 ℃時開始計時，控制此溫度不變，共炒制8 min，迅速出鍋，熄滅火星，攤涼即得烏梅炭[11]。

1.2.2 溶液的制備 稱取烏梅不同炮制品及不同部位樣品1 g，加入50 mL的30%的甲醇，稱定重量，超聲(40 kHz，150 W)提取1 h，用30%的甲醇補足減失的重量。提取液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。精密稱取枸櫞酸159.75 mg置于10 mL的容量瓶中，加入30%的甲醇稀釋至刻度，得到濃度為15.975 mg/mL的對照品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，檢測波長：215 nm，流速：0.6 mL/min，柱溫：25 ℃，流動相：甲醇-0.2%磷酸梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序 (%)

1.2.4 系統適應性試驗 分別精密吸取“1.2.2”項下對照品溶液以及供試品溶液，各20 μL，進樣，按照“1.2.3”項下色譜條件分析，色譜見圖1。在供試品溶液的色譜中，有與混合對照品溶液中枸櫞酸保留時間相同的色譜峰，枸櫞酸的出峰時間為10.560 min，目標峰與雜質分離較好，峰形尖銳，目標峰的理論塔板數不低于7 000，分離度大于1.5，說明系統適應性良好。

圖1 對照品(A)，烏梅提取物(B)的HPLC 色譜(1枸櫞酸)

1.2.5 線性關系考察 精密吸取枸櫞酸對照品溶液0.2、0.6、1.0、1.5、2 mL置5 mL容量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，即得系列對照品溶液，按照“1.2.3”項下色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標，以枸櫞酸對照品溶液的濃度(mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，枸櫞酸的線性回歸方程、相關系數、濃度線性范圍見表2。

表2 枸櫞酸的線性回歸方程、相關系數、濃度線性范圍

1.2.6 加樣回收率 稱取已知含量的烏梅粉末9份，每份約0.1 g，分別精密加入烏梅粉末中枸櫞酸含量約80%、100%和120%的單體對照品溶液，按照“1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，計算枸櫞酸的平均回收率，結果見表3。

表3 枸櫞酸的回收率試驗結果 (mg, n=9)

1.2.7 穩定性、精密度及重復性實驗 取烏梅供試品溶液，室溫下放置0、4、8、12、24 h，按“1.2.3”項下色譜條件分別進樣測定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.56 %，穩定性實驗符合測定要求。取枸櫞酸對照品溶液，按“1.2.3”項下方法連續進樣6次，測定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.47%，精密度實驗符合測定要求。按供試品配制方法平行配制6份，按“1.2.3”項下方法進樣分析，測定峰面積，枸櫞酸的RSD為0.75%。重復性實驗符合測定要求。

1.2.8 含量測定 取烏梅不同炮制品及不同部位樣品，按照“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”項下方法分析，測定不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量。枸櫞酸的含量見表4。

表4 烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量 (n=3)

2 討論

烏梅不同炮制品及不同部位中有機酸的含量差異較大，烏梅核中枸櫞酸的含量約為烏梅肉枸櫞酸含量的1/4。烏梅經過醋制以后，枸櫞酸的含量有明顯的降低，可能是因為在醋泡的過程中導致烏梅有機酸的損失。烏梅炭里面沒有檢測出枸櫞酸，說明烏梅炒炭對有機酸的含量影響較大，烏梅是否去核使用存在爭議，烏梅不同炮制品及不同部位中枸櫞酸的含量測定可為烏梅的質量控制及臨床應用提供依據。