HPLC法測定平糖散中五味子甲素、五味子乙素含量

鄧麗瑩

(阜新市檢驗檢測認證中心，遼寧 阜新 123000)

平糖散為遼寧省阜新市糖尿病醫院的醫院制劑，由五味子、山藥、肉桂及枸杞子四味中藥組成，具有養陰生津、溫腎補腎的功效，主治口渴多飲、口燥咽干、多食以饑、小便頻數、腰痠腿軟、頭暈氣短、疲乏無力、夜寐困難等癥狀。方中五味子為君藥，性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效[1]。現代研究發現五味子可應用于中樞神經系統、心血管系統、消化系統類疾病的治療。除此之外，其還有降血糖、肝保護、抗糖尿病慢性并發癥、增強免疫功能等作用。五味子所含有的五味子甲素、五味子乙素是平糖散的主要有效成分。目前該制劑現行質量標準未進行含量測定質量控制, 故本文采用高效液相色譜法，同時測定五味子甲素和五味子乙素兩種成分的含量。建立的測定方法準確、靈敏度高、重復性良好，適用于平糖散的質量控制，為進一步提高其質量標準提供了科學依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters e2489檢測器，Waters工作站)；BP211D 型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥

五味子甲素對照品(批號0764-200006)、五味子乙素對照品(批號110765-200306)均購自中國食品藥品檢定研究院；平糖散(遼寧省阜新市糖尿病醫院提供，批號：20170907、20170910、20171015、20180312，規格：4 g/袋)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(72∶28)；檢測波長∶254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。理論塔板數以五味子甲素峰計算不少于2 000。色譜見圖1。

1：五味子甲素(Deoxyschizandrin)；2：五味子乙素(Schisandrin B)

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取五味子甲素對照品4.47 mg，置于50 mL量瓶中，五味子乙素2.74 mg，置于25 mL量瓶中，分別加入甲醇至刻度，搖勻，即得五味子甲素對照品溶液(0.089 4 mg·mL-1) ，五味子乙素對照品溶液( 0.109 6 mg·mL-1) 。精密移取五味子甲素對照品溶液13 mL，五味子乙素對照品溶液10 mL于同一50 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取平糖散3袋，研細，取2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按平糖散處方比例及制法，制得不含五味子的陰性樣品，取不含五味子的陰性樣品，按照“2.2.2”項下方法制備即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性考察 將對照品溶液與供試品溶液及陰性對照溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，分別進樣，記錄色譜圖(色譜圖見圖1)。五味子甲素與五味子乙素均能達到基線分離，陰性對照無干擾。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取混合對照的溶液1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進樣20 μL，測定峰面積。以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程為：五味子甲素Y=3 848 754.912 4X-20 101.387 8，R2=1.000 0；五味子乙素Y=3 104 070.15X-59 413.360 5，R2=1.000 0。結果表明，五味子甲素和五味子乙素在0.023 244～0.232 44 μg·mL-1和0.021 92～0.219 2 μg.mL-1濃度范圍內與其各自的峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測定五味子甲素與五味子乙素的峰面積，結果五味子甲素與五味子乙素峰面積的RSD(n=6)分別為0.8%和1.2%，表明儀器進樣精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號平糖散(批號20170907)供試品6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定五味子甲素和五味子乙素的含量，結果五味子甲素與五味子乙素的平均含量為0.195 4 mg·g-1和0.553 3 mg·g-1，RSD(n=6) 分別為1.2%和0.6%。表明方法的重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液(批號：20170907) 20 μL，分別于配制 0、2、4、8、16、24 h 后進樣，測定峰面積，結果五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD(n=6)分別為0.7%、0.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的同一批次( 批號：20170907) 樣品6份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入五味子甲素和五味子乙素濃度為7.75 μg·mL-1和21.92 μg·mL-1的混合對照品溶液25 mL，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，計算2種成分的回收率，結果見表1。

表1 回收率測定結果 (n=6)

2.3.7 樣品含量測定 取平糖散樣品3批，按照“2.2”項下方法制得供試品溶液，按上述色譜條件下分別進樣20 μL，測得峰面積，計算五味子甲素和五味子乙素的含量。結果見表2。

表2 樣品測定結果 (mg·g-1，n=3 )

3 討論

五味子為平糖散的主要成分之一。已有大量研究表明，五味子具有顯著的保肝利肝作用[2]。筆者針對平糖散質量標準中五味子含量測定的空白，建立了HPLC同時測定平糖散中五味子兩種有效成分的方法，為平糖散的質量控制提供了科學依據。

在供試品溶液的制備中，考察以甲醇、乙醇為溶劑，超聲處理15、20、30、60 min以及加熱回流30 min、1 h的提取條件，結果表明，以甲醇為溶劑，加熱回流1 h時待測成分可提取完全，且操作簡單。

對于流動相的選擇，參考有關文獻，考察了甲醇-水、乙腈-水體系，其中甲醇-水(72∶28)對五味子甲素和五味子乙素的分離效果較好，在檢定波長處基線無干擾。高效液相色譜法測定中，分別考察了220 nm、236 nm、250 nm、254 nm的檢測波長，結果表明，選用254 nm分離效果較為理想，無雜質干擾。

采用建立的方法測定了3批平糖散，結果表明，不同批次樣品中五味子甲素和五味子乙素的含量存在差異，這可能與原料五味子的品質有關。五味子作為平糖散的重要有效成分，應保證其原料質量的穩定性，更應確保平糖散中五味子含量的穩定性，建議在質量標準中增加五味子甲素和五味子乙素的含量測定，以反映五味子的含量，使平糖散的質量得到全面控制。