飛龍掌血鎮(zhèn)痛有效部位篩選及機(jī)制研究

張源文，胡祖林，羅彥博，陳麗娟，陳安莉，劉 楊，劉 明*，胡萬福

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

疼痛的治療一直是臨床的難點和熱點。很多人認(rèn)為疼痛只是一種癥狀，并不需要進(jìn)行針對性治療[1]。然而，強(qiáng)忍疼痛可能會帶來嚴(yán)重后果，甚至危及生命。雖然目前臨床上有許多鎮(zhèn)痛藥，但不少都具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如阿片生物堿類鎮(zhèn)痛藥有成癮性，非甾體抗炎止痛藥可誘發(fā)妊娠期急性脂肪肝、胃腸反應(yīng)、阿司匹林哮喘等。因此，尋找高效、安全的鎮(zhèn)痛藥依然是現(xiàn)代研究的熱點。飛龍掌血為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血(Toddaliaasiatica(L.)Lam.)的干燥根或根皮，是貴州苗族習(xí)用藥材。民間常將其用于治療腰痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[2-3]。現(xiàn)代研究表明，其具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，飛龍掌血根皮部分的鎮(zhèn)痛作用超過或相當(dāng)于度冷丁，飛龍掌血根的醇提物和水提物均有鎮(zhèn)痛效果，且水提物強(qiáng)于醇提物。目前已有大量研究表明苗藥飛龍掌血具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，但其鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)、機(jī)制及安全性尚不明確[4]，因此，本研究將對其進(jìn)行初步探討。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

飛龍掌血購于貴陽市藥材市場，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室丁寧老師鑒定為蕓香科植物飛龍掌血(ToddaliaasiaticaLam.)的根。

1.2 實驗動物

昆明種健康小鼠，體重18～22 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.3 實驗試劑

冰醋酸(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號20170906)；正丁醇、乙酸乙酯、石油醚(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑公司)；95%乙醇(重慶川東化工有限公司，生產(chǎn)批號20171101)；小鼠前列腺素 E2(PGE2)ELISA 檢測試劑盒(上海生物科技有限公司，批號：201811)。

1.4 實驗儀器

DM.7-6B智能熱板儀(北京達(dá)美達(dá)科技有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；R-1010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速20～130 rpm，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學(xué)方法

2.2 藥物制備

取飛龍掌血干燥根5 kg，經(jīng)95%乙醇回流提取2次，濾液回收乙醇至無醇味，藥物殘渣再用水煎煮兩次[5]。合并醇、水提取物，濃縮成1 g/mL。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照1∶1的比例對濃縮液進(jìn)行萃取，得到石油醚部位浸膏6 g(提取率為0.12%)、乙酸乙酯部位浸膏29.6 g(提取率為0.6%)、正丁醇部位浸膏86.9 g(提取率為1.7%)和水部位187.3 g(提取率為3.8%)[6]。

2.3 熱板法

參照文獻(xiàn)[7-8]方法，取KM小鼠，雌性，實驗前用智能熱板儀進(jìn)行篩選，選擇舔足時間(痛閾值)為5～30 s的小鼠為合格小鼠。將篩選出來的合格小鼠隨機(jī)分為14組，每組10只，具體分組如下：空白對照組、飛龍掌血石油醚部位高、中、低劑量組，飛龍掌血乙酸乙酯部位高、中、低劑量組，飛龍掌血正丁醇提取部位高、中、低劑量組，飛龍掌血水提部位高、中、低劑量組，其中高、中、低劑量組均按生藥量4 g/kg、2 g/kg、1 g/kg給藥，陽性藥物布洛芬0.039 g/kg組[9-10]。分組后開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，末次給藥30 min后，檢測小鼠的痛閾值。由表1可見，飛龍掌血正丁醇提取部位、水提部位及陽性藥物組能提高小鼠的痛閾值，以正丁醇提取部位組，水提部位高、中劑量組及陽性藥物組效果最為顯著(P<0.01)。

表1 飛龍掌血各提取部位對小鼠痛閾值的影響 (n=10)

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 扭體法

取昆明小鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為14個組，每組10只，除陽性藥物阿司匹林0.2 g/kg組外，其他分組同上。各組灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，末次給藥1 h后腹腔注射0.6% 醋酸0.1mL/10g，觀察15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)并記錄[11]。由表2可見，飛龍掌血各提取部位均能減少醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)，與空白對照組比較，正丁醇提取部位組、水提部位組及陽性藥物組小鼠的扭體次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 飛龍掌血各提取部位對小鼠扭體次數(shù)的影響 (n=10)

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 福爾馬林舔足法

取KM小鼠100只，雌雄各半，分組同上。各組均按體重灌胃給藥，連續(xù)給藥7天，于第7天灌胃1 h后，在小鼠左后足底注射20 μL 2%福爾馬林[12]，分別記錄，測定0～5 min(第Ⅰ相，屬于中樞性疼痛)內(nèi)小鼠的舔足總時間，10～60 min(第Ⅱ相，屬于外周炎性疼痛)內(nèi)的舔足總時間(s)。由表3可見，飛龍掌血正丁醇中、高劑量組和水提部位高劑量組小鼠0～5 min(第Ⅰ相)，10～60 min(第Ⅱ相)的舔足時間均明顯減少。與空白對照組比較，正丁醇部位中、高劑量組及水提部位中、高劑量組第Ⅰ相鎮(zhèn)痛效果差異顯著(P<0.01)，正丁醇部位中、高劑量組，水提部位高劑量組及陽性藥物組第Ⅱ相鎮(zhèn)痛效果差異顯著(P<0.01)。

2.6 飛龍掌血水提物對小鼠血清及大腦中PGE2含量的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取飛龍掌血水提取部位進(jìn)行ELISA檢測。取KM小鼠40只，每組8只，雌雄各半。分組如下：空白對照組、飛龍掌血水提部位高劑量組、飛龍掌血水提部位中劑量組、飛龍掌血水提部位低劑量組和陽性藥物組。每天灌胃給藥，連續(xù)7天，于第7天灌胃1 h后腹腔注射乙酸，注射后1 h采用摘眼球法取小鼠血液，3 500 r/min離心20 min，各組血清稀釋5倍。脫頸椎處死小鼠，剪開小鼠頭部皮膚及頭骨，取出全腦，再加入3 mL生理鹽水進(jìn)行勻漿，12 000 r/min離心后取上清，采用試劑盒說明書方法檢測PGE2含量。由表4可見，與空白對照組比較，飛龍掌血水提部位能明顯降低小鼠血清和腦組織中PGE2含量(P<0.05，P<0.01)。

表3 飛龍掌血各提取部位對小鼠福爾馬林炎性痛的影響 (n=10)

注：與空白對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(g/kg) 血清中PGE2(ng/L)大腦中PGE2(ng/L)空白對照組飛龍掌血水提部位低劑量組飛龍掌血水提部位中劑量組飛龍掌血水提部位高劑量組陽性對照組-1240.2198.78±30.61207.13±23.53215.79±29.07239.95±66.38*176.49±14.87235.27±45.27211.20±28.07199.05±36.96*195.05±21.71*210.97±41.42

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

疼痛既是人體的一種反應(yīng)，也是很多疾病的癥狀。強(qiáng)烈或持續(xù)性的疼痛嚴(yán)重影響患者的生活，因而鎮(zhèn)痛藥的研究一直是熱點。目前臨床上有許多種類鎮(zhèn)痛藥，如解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、中樞性止痛藥、麻醉性止痛藥，但多具有較大的不良反應(yīng)和局限性，如阿片生物堿類鎮(zhèn)痛藥有成癮性，解熱鎮(zhèn)痛抗炎性藥被認(rèn)為是誘發(fā)妊娠期急性脂肪肝的潛在因素且鎮(zhèn)痛強(qiáng)度不夠大[13]。

本研究采用兩個經(jīng)典疼痛模型—醋酸扭體法和熱板法研究苗藥飛龍掌血的鎮(zhèn)痛作用和有效部位。小鼠醋酸扭體實驗通過醋酸刺激引起小鼠腹膜炎癥而產(chǎn)生疼痛，從而表現(xiàn)出扭體反應(yīng)。醋酸扭體法為化學(xué)致痛，借助致痛物質(zhì)的化學(xué)刺激而產(chǎn)生疼痛。本實驗結(jié)果顯示，飛龍掌血提取物能有效減少醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，正丁醇提取部位、水提部位和陽性藥均對扭體反應(yīng)有抑制作用，且正丁醇部位和水提部位效果比陽性藥更顯著，提示飛龍掌血對炎癥性疼痛有一定的抑制作用。而另一個經(jīng)典實驗熱板法屬于物理致痛，借助于熱的刺激使動物產(chǎn)生疼痛，這種刺激通過傳入神經(jīng)傳給中樞，產(chǎn)生疼痛的感覺。熱板法是一種反射性測痛模型，對僅具有外周鎮(zhèn)痛作用的非甾體抗炎藥不敏感，但其早已用于鎮(zhèn)痛藥物和生理疼痛的研究中，是目前藥理實驗中比較經(jīng)典的測定中樞鎮(zhèn)痛作用模型。本實驗結(jié)果顯示，飛龍掌血正丁醇提取部位、水提部位和陽性藥均具有明顯的鎮(zhèn)痛效果(P<0.01)。福爾馬林舔足法是通過化學(xué)傷害性刺激引起的持續(xù)性疼痛研究藥物鎮(zhèn)痛作用的方法。PGE2既是炎癥介質(zhì)也是疼痛介質(zhì)，能直接刺激神經(jīng)末梢感受器產(chǎn)生疼痛，或增加神經(jīng)末梢對刺激的敏感性，導(dǎo)致痛覺閾值降低從而引發(fā)痛覺。ELISA檢測結(jié)果顯示飛龍掌血水提物高劑量組小鼠血清中PGE2含量明顯降低，飛龍掌血水提物中劑量和高劑量組小鼠腦中PGE2含量明顯降低，提示其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制疼痛介質(zhì)PGE2的表達(dá)有關(guān)。本實驗為飛龍掌血鎮(zhèn)痛作用的研究奠定了一定基礎(chǔ)。