柑橘皮生產單細胞蛋白飼料的固態發酵工藝研究

李佳瑤，周 珺，王 媛，溫宇嬋，趙寶頂，張 怡

(天津農學院農學與資源環境生物技術系 天津300384)

0 引 言

柑橘是世界第三大貿易農產品。目前，全國每年產生的柑橘皮渣在千萬噸以上[1]，對柑橘皮渣的處理已成為各食品加工企業的重大難題。柑橘皮渣含有豐富的碳水化合物、脂肪、維生素、氨基酸和礦物質等營養成分，可以作為微生物發酵的基質。同時，柑橘皮渣中含有大量的纖維素、木質素和果膠類等生物大分子物質[2]，經過處理可將其降解為微生物可利用的小分子物質，生產附加值高的單細胞蛋白新飼料。固體發酵作為一種發酵方法，過程容易控制、能耗低、操作簡單、發酵產物高、對無菌環境要求相對低、不易發生大面積污染。本實驗以柑橘皮為原料，通過測定已降解粗纖維和生成蛋白質含量，優化發酵培養基配方，在保證蛋白質含量較高的前提下，選取粗纖維降解率較大的生產工藝。

1 材料和方法

1.1 實驗器材和試劑

1.1.1 實驗器材

粉碎機、電爐、凱氏定氮儀、冷凝管、真空泵、烘箱、電阻爐、干燥器。

1.1.2 試劑

0.882 mol/L氫氧化鈉、3.5mL硫酸、無水乙醇、40%氫氧化鈉溶液、2%硼酸、25%氫氧化鈉溶液、10%硫酸銅溶液、0.1%甲基紅、0.1%溴甲酚綠、大約0.1mol/L鹽酸、尿素、硫酸銨、2g/100mL磷酸二氫鉀、0.25g/100mL硫酸鎂。

1.1.3 菌種

混合菌種(綠色木霉、康寧木霉、枯草芽孢桿菌)通過淘寶網購自蘇柯漢生物酶制劑。

1.2 制備柑橘皮渣

將柑橘剝取外皮，洗凈、烘干、粉碎成末，即得到柑橘皮渣。

1.3 正交培養基配方設計

以柑橘皮渣 9g和麩皮 1g為發酵底物，加入混合菌種0.1g，利用4水平 5因素正交試驗，對尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水的添加量進行優化，培養溫度為 30℃，培養時間為 72h。通過測定蛋白質和已降解粗纖維，篩選最佳培養基配方，確定最佳工藝。

表1 正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experiment design

1.4 采用凱氏定氮法測定蛋白質含量

稱取 10g固體發酵后樣品置于燒杯中加水，水沸騰后計時，30min后立即依次加入適量的氫氧化鈉和硫酸銅溶液，沉淀靜置 2h以上或過夜；溶液中沉淀用濾紙抽濾，溫水洗滌 5～6次直至檢驗無硫酸根離子為止，沉淀連同濾紙放入 75℃干燥箱中干燥60min。將消化管潤洗后放入 25℃干燥箱中烘干；將沉淀物放入消化管中，加入催化劑和 15mL硫酸在通風櫥中消化 1～1.5h，消化管中顏色變至淺黃色后加 5～6滴水，再消化 0.5h，當顏色為淺藍色或接近無色時取出冷卻。測定空白體積，再滴定樣品，向消化管中加入鹽酸、水、氫氧化鈉、硼酸和指示劑，以溶液顏色由藍綠色變為灰紅色為終點。將儀器按說明書清洗，測試儀器穩定性 2～3次，所得滴定數據極差不超過0.05，所得滴定體積即為測定蛋白質空白體積[3-4]。此外測定空白體積一次。

1.5 采用酸堿法測量纖維素含量

將 1.734g固體發酵后樣品和 200mL煮沸的硫酸進行回流，加熱使之微沸并經過 30min后樣品質量記作 W(g)。在圓底燒瓶中加入 200mL煮沸的氫氧化鉀溶液，加熱沸騰后回流 30min，取濾紙在105℃下烘10min稱重記作W0(g)。將圓底燒瓶中所有溶液抽濾，再用熱蒸餾水充分洗滌至中性后加入60℃無水乙醇 25mL，然后洗滌、再抽濾。將濾紙及濾紙上的殘留物放入坩堝中，將坩堝和內容物置于130℃的烘箱中烘 120min至恒重，立即閉蓋并放入干燥器中 30min，即得殘留物，稱重記作 W1(g)。將坩堝放在電爐上加入直至無煙拿出。將炭化的坩堝放入電阻爐中，電阻爐溫度大約為550℃時開始計時30min，灼燒至恒重，取出將其放入干燥器中30min，稱重記作W2(g)[5-6]。

計算：已降解的纖維素百分含量=100%-(W1-W2-W0)/W×100%

式中：W 為樣品初始質量；W0為烘干后濾紙的質量；W1為坩堝和內容物烘干后的質量；W2為坩堝和內容物灰化后的質量。

1.6 最佳配方重復

柑橘皮中已降解粗纖維和蛋白質含量測定后，使用DPS軟件對數據進行處理，通過正交試驗，得出最佳結果，選出最佳培養基。

2 結果與分析

2.1 柑橘皮固態發酵正交試驗產蛋白含量

采用正交試驗方法，進行不同配方的發酵培養基試驗，測定蛋白質含量，結果如表2。

表2 蛋白質含量Tab.2 Protein content

續表2

從 R值可知，影響正交實驗結果的因素依次為A＞B＞D＞E＞C，即影響降解纖維素的因素依次為尿素＞硫酸銨＞硫酸鎂＞水＞KH2PO4。從 K值可知，在 A4B4C3D4E3的配方下，蛋白質有較高產量。從相關系數可知，尿素、硫酸銨、硫酸鎂、水呈現正相關，磷酸二氫鉀呈現負相關。

2.2 柑橘皮固態發酵正交試驗已降解粗纖維

從 R值可知，影響正交實驗結果的因素依次為C'＞E'＞A'＞D'＞B'，即影響降解纖維素的因素依次為KH2PO4＞水＞尿素＞硫酸鎂＞硫酸銨。從K值可知，在 A'1B'2C'4D'1E'1的配方下，纖維素的降解程度最大。從相關系數可知，硫酸銨和磷酸二氫鉀呈現正相關，尿素、硫酸鎂和水呈負相關(表3)。

2.3 重復試驗結果與分析

結合以上兩組相關性數據進行分析，發現兩組數據中硫酸銨均為正相關。因為本實驗以生成的蛋白質含量為最終目標，所以觀測指標是以生成的蛋白質含量為主。在表1中，尿素、硫酸鎂、水呈現正相關；表2中，硫酸二氫鉀呈現正相關。綜合上述相關性結論分析，最佳配方為0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g磷酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和14mL水。

取上述最佳配方進行重復試驗：以柑橘皮渣 9g和麩皮 1g為發酵底物，加入混合菌種 0.1g，在含0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g硫酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和 14mL水的培養基 30℃培養72h。培養完成后，測定蛋白質含量和已降解纖維素，結果如表4。

由表4可知，此次重復實驗結果中生成蛋白質含量和已降解的纖維素雖沒有高于正交試驗中最大值，但也處于相對較高的水平。結合上述相關性分析，重復試驗結果與相關性分析結論相符，所以優化后配方在保證蛋白質產量的基礎上更大程度地降解了纖維素，初步判斷此配方適用。

表3 已降解的粗纖維Tab.3 Degraded crude fiber

表4 最佳配方重復實驗Tab.4 Results of repeated experiments

3 討論與結論

①在接種的時候一定要將菌種均勻地接入到固體培養基中。在固體培養基中菌體活動能力沒有在液體培養基中強，接種不均勻可能導致菌體生長不一，獲得營養成分不等之類問題，會給試驗結果帶來影響。而且，固體發酵底料要妥善保存，避免染菌變質導致其中營養被消耗。

②綜合試驗結果可知，混合菌種(綠色木霉、康寧木霉、枯草芽孢桿菌)在 30℃的條件下，以柑橘皮為主要原料，0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g硫酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和 14mL水的培養基中培養72h，可在保證蛋白質高產量的基礎上更大程度地降解纖維素。