光動力療法聯合拉帕替尼抑制人表皮生長因子受體-2陽性乳腺癌細胞的基礎研究

孫蓓，張麗，劉曉東，佟仲生

人表皮生長因子受體-2（HER2）陽性表達的乳腺癌患者常治療失敗率及復發率高，預后較差。拉帕替尼（LAP）屬于一類常見的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑，其目前在抗腫瘤領域應用廣泛，且在實際應用中表現出顯著的抗腫瘤活性作用［1-3］。光動力療法（PDT）對增生性疾病有很好的治療效果，其在抗腫瘤治療中表現出高效、毒副作用小等優點，其與化療、靶向治療等聯合進行抗腫瘤治療已經成為研究的熱點，但是大部分研究主要集中在胸腹腔腫瘤，而其在乳腺癌中的研究報道較少，并且其抗腫瘤的機制尚不清楚［4-6］。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是血紅素合成過程中糞卟啉Ⅲ原卟啉IX（PpIX）的前體。氨基乙酰丙酸（ALA）-PDT實現了由外源光敏劑的直接輸入到ALA在組織內內源性生成原卟啉光敏劑經光照射啟動PDT的突破。本研究探討新型光敏劑5-ALA用于PDT對HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3的抑制情況，并分析其具體機制，同時討論PDT聯合LAP對HER2陽性乳腺癌的治療效果，以期為HER2陽性乳腺癌的治療提供實驗依據，為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究時間 本研究時間為2016年5月—2017年12月。

1.2 主要儀器及試劑 半導體激光光動力治療儀（天津市雷意激光技術有限公司），5-ALA、MTT、Rhodamine 123（美國Sigma公司），LAP（英國葛蘭素史克公司，批號：H201006493），胎牛血清、胰蛋白酶、細胞培養基（美國Gibco公司），流式細胞術檢測試劑盒及抗體（美國BD公司）。

1.3 MTT法檢測細胞生長抑制率 將對數生長期的HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3隨機分為空白對照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設3個復孔。空白對照組：不做干預。LAP組：分別加入不同濃度梯度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol/L）的 LAP，孵育24 h；PDT組：分別加入不同濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）的5-ALA，孵育3 h給予激光照射；LAP+PDT組：分別加入不同濃度梯度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol/L）的LAP，孵育21 h，再加入不同濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）的5-ALA，孵育3 h給予激光照射。PDT組及LAP+PDT組光照能量密度為2.5 J/cm2，PDT治療完畢后更換完全培養基，其他條件不變情況下繼續培養16 h。通過光度計檢測各組562 nm處的吸光度值，即細胞生長抑制率，繪制各組不同給藥濃度下的細胞生長抑制率曲線。分別計算LAP和5-ALA的半數抑制濃度（IC50），確定最佳給藥濃度及后續研究LAP組、PDT組、LAP+PDT組給藥濃度。分別比較各組在最佳給藥濃度下24、48 h時的細胞生長抑制率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 將對數生長期的HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3隨機分為空白對照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設3個復孔。空白對照組：不做干預。LAP組：加入1.00 μmol/L的LAP，孵育24 h；PDT組：加入1.00 mmol/L的5-ALA，孵育3 h給予激光照射；LAP+PDT組：加入1.00μmol/L的LAP，孵育21 h，再加1.00 mmol/L的5-ALA，孵育3 h給予激光照射。PDT組及LAP+PDT組光照能量密度為2.5 J/cm2，PDT治療完畢后更換完全培養基，其他條件不變情況下繼續培養16 h。消化之后收集細胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分沖洗細胞2遍；加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，避光孵育 15 min，加入緩沖液400 μl，采用流式細胞術檢測試劑盒檢測各組細胞凋亡情況。

1.5 Rhodamine123法檢測綠色熒光強度及線粒體膜電位 將對數生長期的HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3隨機分為空白對照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設3個復孔。各組細胞處理情況同1.4。加入線粒體探針Rhodamine123，終濃度為10 μg/ml，避光孵育30 min，棄培養基，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍。胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液，PBS清洗細胞2次，倒置熒光顯微鏡下觀察各組綠色熒光強度，采用流式細胞儀檢測各組線粒體膜電位。實驗獨立重復3次，取平均值。

1.6 Western blotting法檢測HER2表達水平 將對數生長期的HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3隨機分為空白對照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設3個復孔。各組細胞處理情況同1.4。各組取5×106個細胞，加入500 μl預冷的細胞裂解液，置于冰浴中作用60 min，4 ℃ 1 200 r/m離心10 min（離心半徑6 cm），吸出上清液，加入等體積的2×Loading buffer，沸水浴10 min，配置分離膠、積層膠，取電泳樣品上樣，每道20 μl，電泳，轉膜。5%脫脂奶粉封閉處理2 h，加入一抗，4 ℃孵育12 h，洗膜，加入1∶20 000辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，震蕩孵育2 h，洗膜，加入化學發光底物（Luminol/Enhancer Solution和Stable Peroxide Solution按1∶1比例混合均勻），暗室孵育5 min。棄去發光底物，X線曝光顯影。計算HER2表達水平。實驗獨立重復3次，取平均值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用金正均q值法［7］判斷聯合治療的協同作用，Q=實際聯合藥效R'（A+B）/理論聯合藥效R（A+B），R（A+B）=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨用藥藥效，Q＜0.85為拮抗，0.85≤Q＜1.15為相加，Q≥1.15為協同。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長抑制率 LAP的IC50為1.65 μmol/L，選取1.00 μmol/L（LAP組細胞的生長抑制率為40.12%）為后續研究LAP組、LAP+PDT組給藥濃度（見圖1）。5-ALA的IC50為1.57 mmol/L，選取1.00 mmol/L（PDT組細胞的生長抑制率為41.23%）為后續研究PDT組、LAP+PDT組給藥濃度（見圖2）。當LAP為1.00 mmol/L，5-ALA為1.00 μmol/L時，LAP+PDT組細胞生長抑瘤率為79.71%。聯合治療Q≈1.23，表明LAP與5-ALA聯合治療表現出良好的協同效果。

4組24、48 h細胞生長抑制率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組24、48 h細胞生長抑制率均大于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；PDT組48 h細胞生長抑制率大于LAP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP+PDT組24、48 h細胞生長抑制率均大于LAP組、PDT組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

圖1 LAP組與LAP+PDT組不同給藥濃度下的細胞生長抑制率曲線（LAP+PDT組5-ALA為1.00 mmol/L）Figure 1 Cell growth inhibition rate curves at different concentrations in LAP group and LAP+PDT group（5-ALA used in LAP+PDT group was 1.00 mmol/L）

圖2 PDT組與LAP+PDT組不同給藥濃度下的細胞生長抑制率曲線（LAP+PDT組LAP為1.00 μmol/L）Figure 2 Cell growth inhibition rate curves at different concentrations in PDT group and LAP+PDT group（LAP used in LAP+PDT group was 1.00μmol/L）

表1 4組24、48 h細胞生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of growth inhibition rates at 24，48 hours after intervention with the optima concentration in four groups

表1 4組24、48 h細胞生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of growth inhibition rates at 24，48 hours after intervention with the optima concentration in four groups

注：LAP=拉帕替尼，PDT=光動力療法；與空白對照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 24 h 48 h空白對照組 4.70±0.70 7.70±0.70 LAP 組 26.12±2.09a 45.12±3.42a PDT 組 32.46±4.12a 62.46±6.73ab LAP+PDT組 70.02±7.75abc 83.27±13.74abc F值 144.340 66.622 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis in each group detected by flow cytometry

2.2 細胞凋亡情況 空白對照組主要為活細胞；與空白對照組相比，LAP組、PDT組的細胞主要表現為凋亡，LAP+PDT組則出現了明顯的凋亡和壞死，早期凋亡占比很低（見圖3）。

2.3 綠色熒光強度及線粒體膜電位 綠色熒光強度：對照組細胞狀態良好，細胞為綠色熒光，胞漿著色深；LAP組、PDT組熒光強度有所降低；LAP+PDT組的熒光強度降低最明顯，提示活細胞減少（見圖4）。線粒體膜電位：4組線粒體膜電位比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于LAP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP+PDT組線粒體膜電位低于PDT組，差異有統計學差異（P＜0.05，見圖5、表2）。

2.4 HER2表達水平 4組HER2表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組HER2表達水平均低于空白對照組，差異有統計學意 義（P＜0.05）；PDT組、LAP+PDT組 HER2表達水平均低于LAP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；LAP+PDT組HER2表達水平均低于PDT組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖6、表3）。

3 討論

圖4 各組綠色熒光強度（×200）Figure 4 Fluorescence intensity of green fluorescent protein in each group

表2 4組線粒體膜電位比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mitochondrial membrane potential in four groups

表2 4組線粒體膜電位比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mitochondrial membrane potential in four groups

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 線粒體膜電位空白對照組 66.56±7.79 LAP組 49.16±9.38a PDT組 34.96±7.32ab LAP+PDT組 22.52±6.96abc F值 22.894 P值 ＜0.001

圖5 Rhodamine123法檢測各組線粒體膜電位Figure 5 Mitochondrial membrane potential in each group detected by Rhodamine123

圖6 Western blotting法檢測各組HER2表達水平的凝膠電泳圖Figure 6 Expression level of HER2 in each group by gel electrophoresis with Western blotting

表3 4組HER2表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression level of HER2 in four groups

表3 4組HER2表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression level of HER2 in four groups

注：HER2=人表皮生長因子受體-2；與空白對照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 HER2空白對照組 1.65±0.30 LAP組 1.24±0.11a PDT組 0.88±0.15ab LAP+PDT組 0.27±0.06abc F值 41.717 P值 ＜0.001

在乳腺癌患者中，HER2高表達是預后不良的重要因素，治療的失敗率及復發率高，生存時間短［8］。而在相關新技術的不斷應用下，乳腺癌的治療效果不斷提高，且患者的預后也改善，不過有一部分患者在治療過程中出現了一定的遠處轉移，導致治療效果較差，其中約10%的胸壁復發［9］。嚴重者會出現皮膚潰爛、流血、化膿感染，極大影響患者的生活質量及預后。PDT對增生性疾病有很好的治療效果，其在抗腫瘤治療中表現出高效、毒副作用小等優點。多項實驗證實，光動力治療儀通過調節波長可以使光波穿透至皮下1～2 cm，其可以很好地治療乳腺癌胸壁復發的表淺病灶，且治療后的復發率低［10］。顧瑛等［11］研究發現，活性氧成分在血卟啉單甲醚誘導乳腺癌細胞的凋亡方面有很好的效果，且其可以生成單態氧而促使乳腺癌細胞壞死，同時還誘導乳腺癌細胞凋亡［12］。單態氧在PDT治療過程中可以通過光敏性損傷起作用，可以破壞細胞脂質膜，進而影響細胞的通透性，導致細胞腫脹壞死，同時還影響細胞內多種酶活性。然而目前PDT與靶向治療聯用的協同效應還不是很明確。LAP屬于一類很常用的酪氨酸激酶抑制劑，其目前在抗腫瘤靶向治療領域有著廣泛的應用，且表現出多方面的抗腫瘤活性［13-14］。本研究探討新型光敏劑5-ALA用于PDT對HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3的抑制情況，并分析其具體機制，同時討論PDT聯合LAP對HER2陽性乳腺癌的治療效果，以期為患者的治療提供支持和依據。

KHDAIR等［15］發現，PDT聯合阿霉素能夠明顯抑制耐藥的腫瘤細胞增殖。CANTI等［16］將化療與PDT治療相結合，構建小鼠荷瘤模型，發現聯合PDT治療可使低劑量化療藥物抑瘤作用明顯增強。本研究結果顯示，當LAP為1.00 mmol/L，5-ALA為1.00 μmol/L時，LAP+PDT組細胞生長抑瘤率為79.71%；聯合治療Q≈1.23；表明LAP與5-ALA聯合治療表現出良好的協同效果。與空白對照組相比，LAP組、PDT組的細胞主要表現為凋亡，LAP+PDT組則出現了明顯的凋亡和壞死，早期凋亡占比很低，這可能與二者聯用引起細胞膜、線粒體及細胞器等損傷，導致細胞死亡有關。LAP組、PDT組、LAP+PDT組24、48 h細胞生長抑制率均大于空白對照組，PDT組48 h細胞生長抑制率大于LAP組，LAP+PDT組24、48 h細胞生長抑制率均大于LAP組、PDT組，提示PDT聯合LAP對HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3可起到更好的抑制效果。

光敏劑在PDT治療中的作用方式和其定位存在一定的相關性，而其定位于線粒體的比例較高。如苯卟啉衍生物單元酸A及亞甲藍等在治療過程中可以導致凋亡相關因子（Bcl-2家族、p53基因家族）的變化，進而引發細胞的凋亡和壞死［17-18］。本研究結果顯示，與空白對照組相比，LAP組、PDT組熒光強度有所降低，LAP+PDT組的熒光強度降低最明顯；LAP組、PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于空白對照組，PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于LAP組，LAP+PDT組線粒體膜電位低于PDT組；據此可判斷出PDT治療相關的腫瘤細胞凋亡作用與線粒體膜滲透性移位存在密切的關系，且PDT聯合LAP治療的效果更好。

LAP屬于一類常見的小分子靶向藥物，對HER2陽性乳腺癌患者的治療效果明顯，其主要以HER2基因為作用靶點，然而PDT聯合LAP治療HER2陽性乳腺癌的效果不是很確定。本研究結果顯示，LAP組、PDT組、LAP+PDT組HER2表達水平均低于空白對照組，PDT組、LAP+PDT組HER2表達水平均低于LAP組，LAP+PDT組HER2表達水平均低于PDT組，說明PDT聯合LAP能協同增強抗HER2治療的效果。

綜上所述，新型光敏劑5-ALA用于PDT對HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3具有明顯的抑制作用，且PDT聯合LAP的抑制作用更強，其機制與降低腫瘤細胞線粒體膜電位、HER2表達水平有一定關系。因此，PDT聯合LAP有望改善HER2陽性乳腺癌患者生活質量，提高其生存率，具有良好的應用前景。

本研究局限性：

光動力療法（PDT）聯合拉帕替尼（LAP）是通過何種具體機制起到協同增效作用尚需進一步實驗驗證；由于PDT較難達到2 cm以下深層病灶，因此程度較深的胸壁復發治療尚待進一步探索。

作者貢獻：孫蓓進行文章的構思與設計、結果的分析與解釋，撰寫論文；張麗進行統計學處理、論文的中英文修訂；劉曉東進行數據收集與整理；佟仲生進行研究的實施與可行性分析，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。