不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響研究

張慧娜　王麗媛　習海濤

[摘要] 目的 探討不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響。 方法 選擇37例弱精患者的精液標本作為研究對象。所有研究對象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鮮精液標本，用計算機輔助精子分析（CASA）檢測精子各項參數。加入己酮可可堿使其終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L，檢測精子活力和活率及運動功能[包括精子直線速度（VSL）和曲線速度（VCL）]。 結果 與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時間精子活力、精子活率、VSL和VCL均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）。 結論 己酮可可堿濃度1.0 mmol/L孵育60 min對精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子運動功能最佳。

[關鍵詞] 己酮可可堿;精子活力;精子活率;精子運動功能

[中圖分類號] R698.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）15-0035-04

Effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm function

ZHANG Huina? ?WANG Liyuan? ?XI Haitao

Reproductive Center， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325200， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm motor function. Methods The semen specimens of 37 patients with weak sperm were used as research objects. All subjects were abstinent for 3-7 days， and all the fresh semen samples were obtained by masturbation. Computer-assisted sperm analysis（CASA） was used to analyze sperm parameters. Pentoxifylline was added to make the final concentration was 0.1 mmol/L， 0.3 mmol/L， 0.6 mmol/L， 1.0 mmol/L， 3.0 mmol/L， 5.0 mmol/L. The sperm motility and sperm motility rate and sperm motor testing （including sperm linear velocity（VSL） and curvilinear velocity（VCL） was detected. Results Compared with the those of 0.1 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in remaining groups increased at different time points（P<0.05）. Compared with those of 0.3 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in 0.6 mmol/L group， 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group increased（P<0.05）. Compared with those of 0.6 mmol/L group，the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. The sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the 1.0 mmol/L group were higher than those of 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. Compared with those at 10 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the different concentration groups increased at 30 min， 60 min and 120 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Compared with those at 30 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the different concentration groups at 60 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Conclusion The concentration of pentoxifylline at 1.0 mmol/L for 60 min has the best effect on sperm function， sperm motility， sperm motility rate and sperm motor function.

[Key words] Pentoxifylline; Sperm motility; Sperm motility rate; Sperm motor function

隨著現代社會工業化發展，輻射、藥物及環境毒物等的毒副作用及遺傳因素的影響，人類的精子數量和質量呈現出普遍下降趨勢，男性不孕育的比例顯著增加[1-2]。探討改善和提高男性精子活力和質量的新方法已成為當前生殖醫學研究的熱點和重點。為改善患者精子活力并增強弱精子癥的受精能力，人們已經嘗試研究過多種體外精子制備技術和化學刺激試劑，將精子同活力刺激藥物混合孵育來改善人工受精和試管成功率[3-4]。己酮可可堿是甲基黃嘌呤中一種，具有改善少弱精子癥的活力[5]。因此，本文研究旨在探討不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017年6～12月在我院就診的弱精患者37例的精液標本作為研究對象，所有研究對象均依據世界衛生組織（WHO）精子的診斷標準，經醫院倫理委員會批準。納入的37例患者中，年齡21～32歲，平均（27.43±4.13）歲;職業：公務員8例，工人13例，農民12例，其他4例;合并糖尿病5例，合并高血壓9例。所有研究對象均禁欲3～7 d后試驗。

納入標準：（1）年齡≥18歲且≤40歲;（2）血常規、肝腎功能正常;（3）獲得知情同意，簽訂知情同意書。排除標準：（1）合并心肺、肝腎功能嚴重異常者;（2）精神疾病者;（3）合并腫瘤、免疫性疾病及造血系統等異常者。

1.2 方法

所有研究對象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鮮精液標本，將其放置于37℃條件下，恒溫水浴箱中30 min左右，完全液化后備檢。用計算機輔助精子分析（CASA）檢測精子各項參數，每份標本觀察精子數≥200個，且觀測15個視野，測定精子活力和活率。

正常精液標本置于37℃水浴箱20 min，待其完全液化后，每份精液各取1 mL，置于離心管內，用含10%血清Earles培養液（美國Sigma公司）1：1對倍稀釋;加入10%血清Earles培養液2 mL充分混合均勻，以離心半徑10 cm、1500 r/min，離心8 min;將上清液棄去，加入含10%血清Earles培養液2 mL充分混合均勻，以離心半徑10 cm、1500 r/min，離心8 min;將上清液棄去，混勻沉淀物，緩慢加入10%血清Earles培養液1.5 mL左右，注意形成界面，放置于37℃5% CO2培養箱中上游30 min;收集云霧狀的上清液混合于無菌玻璃管，加入BWW培養液調整精子密度至20×106/mL備用。加入己酮可可堿使其終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L。并且在孵育10 min、30 min、60 min、120 min進行活力和活率檢測及精子運動功能檢測[包括精子直線速度（VSL）和曲線速度（VCL）]。

1.3 觀察指標

（1）觀察不同濃度己酮可可堿作用不同時間精子活力變化;（2）觀察不同濃度己酮可可堿作用不同時間精子活率變化;（3）觀察不同濃度己酮可可堿不同作用時間對精子運動功能的影響。

1.4 統計學方法

采用統計學軟件SPSS22.0分析處理數據，其中對于多組間計量資料采用方差分析，兩組間計量資料采用t檢驗，組內計量資料采用配對t檢驗，組間計量資料采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度己酮可可堿作用不同時間精子活力變化比較

見表1。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時間精子活力均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活力增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活力增加（P<0.05）。

2.2 不同濃度己酮可可堿作用不同時間精子活率變化比較

見表2。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時間精子活率均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活率增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活率增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活率增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活率增加（P<0.05）。

2.3 不同濃度己酮可可堿不同作用時間對精子運動功能變化比較

見表3。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時間VSL和VCL均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組VSL和VCL增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組VSL和VCL高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min VSL和VCL增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min VSL和VCL增加（P<0.05）。

3 討論

精子運動是一個高度消耗能量的過程。精子線粒體內產生的ATP可能是精子活動的能量，且受酵解過程直接影響[6]。推測精子代謝過程主要是糖酵解及少量的氧化磷酸化作用所產生，這些過程均受細胞內腺苷酸環化酶系統控制[7-10]。己酮可可堿是從可可豆中提取的可可豆堿，再引入己酮基而得到的一種生物堿，為黃嘌呤衍生物，其分子式為C13H20N4O3，化學名稱為3，7-二甲基磺嘌呤，具有類似可可堿、咖啡因和茶堿的特性，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，能夠阻止環腺苷酸（cAMP）轉為腺苷酸（AMP），防止cAMP的降解，從而使細胞內cAMP濃度升高[11-14]。cAMP則是影響精子代謝過程的一個關鍵因素。大量研究證實，其參與了許多與精子生理和受精能力相關的關鍵過程：如超激活運動（hyperactivated motility，HAMA）和精子頂體反應（acrosome reaction，AR）[15-16]。

己酮可可堿刺激精子活力及功能的機制尚未被完全闡明。cAMP涉及多種精子功能的調控，如精子尾部軸絲的運動、離子流入和蛋白質的磷酸化作用，影響精子活動所需能量的產生，從而加強人精子的活動能力[17]。cAMP改善精子能力的另一可能機制是調節精子細胞膜上鈣離子的轉運，引起細胞鈣離子發生相應變化，導致細胞內鈣水平的變化。鈣離子是細胞第二信使，細胞內游離鈣離子濃度的改變是細胞生理功能的重要物質基礎，也是多種受體激活后信號傳遞的中心環節。精子膜上含有豐富的多聚不飽和脂肪酸及多種蛋白成分，精子膜完整且具有良好的功能與精子獲能、頂體反應及精卵結合密切相關。過氧化物歧化酶可能被一種膜結合蛋白系統調節，PTX刺激這種蛋白激酶系統且抑制活性氧類物質產生，可能作為一種抗氧化劑及自由基清除劑，通過降低細胞內自由基水平，去除自由基上形成的過氧化物而達到保護頂體膜且維護頂體反應的作用[18]。

在哺乳動物精子中如果是短時間用己酮可可堿處理，精子可以對PTX的毒性產生較強的耐受性，而較長時間的處理會對受精卵和早期胚胎產生很強的毒性作用。采用體外活體染色方法觀察結果表明：隨著己酮可可堿處理精子時間的過分延長，精子膜的完整性明顯降低，精子死亡率增加。過多的處理過程本身也可能造成精子功能減退及與透明帶結合能力的喪失[19-20]。因此己酮可可堿孵育時間及濃度差異甚至精子的制備，不同的檢測方法及評價體系都可能造成最終結果的差異。本文研究表明，1.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL高于0.1 mmol/L組、0.6 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組，60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL高于10 min、30 min和120 min。

綜上所述，己酮可可堿濃度1.0 mmol/L孵育60 min對精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子運動功能最佳。由于目前臨床上相關研究報道甚少，缺乏有效的臨床參考價值。本文作為初步探討，筆者認為存在一些不足之處，觀察研究對象相對較少，納入濃度相對較少，因此還需在后續進一步研究中增加研究對象和濃度，提供可靠的參考價值。

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