紫外—可見分光光度法測定烏靈膠囊總黃酮含量的方法研究

郭慧玲， 張亞軍

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥局，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050）

烏靈膠囊是從我國珍稀藥用真菌烏靈參中分離獲得的菌種，經(jīng)現(xiàn)代生物工程技術(shù)精制而成的純中藥制劑。烏靈參是生長在土棲白蟻巢中的一種真菌的菌核，據(jù)《四川中藥志》記載，烏靈參（Xylariasp）具有利尿、補心神、治失眠、吐血及產(chǎn)后失血等藥用價值[1]。烏靈膠囊收載于《中國藥典》2010年版一部，具有補腎健腦、養(yǎng)心安神的功效，臨床用于心腎不交所致的失眠、健忘、心煩心悸、神疲乏力、腰膝酸軟、頭暈耳鳴、少氣懶言、脈細或沉無力等[2]。烏靈膠囊含有腺苷、腺嘌呤、尿苷、鳥苷、多糖、甘露醇、麥角甾醇、膽甾醇、β-谷甾醇及門冬氨酸、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、賴氨酸等19種氨基酸（其中9種必需氨基酸），此外還含有鐵、鋅、錳、銅、磷、鎂、鈣、鍺和維生素（B1、B2、B6、E、A、D2、K1）等多種成分[3]。但對烏靈膠囊中所含有的具有廣泛生理效應(yīng)（如抗炎、抗病毒、利膽、強心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤[4-8]）的總黃酮的研究尚未見文獻報道，為此本課題組在其總黃酮含量測定方面做了相應(yīng)的研究，以期為烏靈膠囊的二次開發(fā)提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；10 000 r/min TGL-16C型離心機（上海安亭科學儀器廠）；5 000 r/min L-5-型離心機（海安亭科學儀器廠）；V2550型紫外分光光度計（日本島津）；XMTD-204型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市國旺實驗儀器廠）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.2 樣品與試劑 烏靈膠囊（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，批號：20170707、20170708、20170709）。體積分數(shù)95%乙醇（CH3CH2OH，浙江三鷹化學試劑有限公司產(chǎn)品）；無水乙醇（杭州大方化學試劑廠產(chǎn)品）；氫氧化鈉（NaOH，河南爾康制藥有限公司產(chǎn)品）；亞硝酸鈉（NaNO2，天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品）；硝酸鋁[Al（NO3）3，上海振欣試劑廠]；甲醇（CH3OH，天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品）；氯化氫（HCl，浙江三鷹化學試劑有限公司產(chǎn)品）；鎂粉（上海精化科技研究所產(chǎn)品）；三氯化鋁（AlCl3，常州市振安化工有限公司產(chǎn)品）；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格：100 mg/支，批號：100080-201207）；培養(yǎng)基（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法及測定波長選擇

2.1.1 AlCl3顯色法（A法） 吸取供試品溶液0.4 mL，置于25 mL容量瓶中，加4%的AlCl3甲醇液0.5 mL，加甲醇至刻度，搖勻，靜置40 min；以相應(yīng)試劑為參比，在波長200～600 nm范圍內(nèi)掃描，測定波長最大吸收。結(jié)果在350 nm處有最大吸收，但極不穩(wěn)定。測未顯色供試液（以相應(yīng)試劑為參比），在波長200～600 nm范圍內(nèi)掃描，測定波長最大吸收。在350 nm處無最大吸收。通過以上比較分析認為，本法不適用于烏靈膠囊中總黃酮的含量測定。

2.1.2 鹽酸—鎂粉顯色法（B法） 供試品溶液（烏靈提取液），吸取對照品溶液、供試品稀釋液2 mL，分別置加有200 mg鎂粉的25 mL具塞比色管中。各加體積分數(shù)60%乙醇至3 mL，搖勻，將比色管置于10～15℃冷水浴中。緩慢滴加濃HCl 2 mL并不時振搖，蓋塞搖勻，沸水浴中加熱1 h，迅速冷卻至室溫。加體積分數(shù)60%乙醇至5 mL刻線，搖勻，靜置20 min。以相應(yīng)試劑為空白，在200～600 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯色后在285 nm處有最大吸收，但未顯色的供試品溶液、對照品溶液在280 nm處有吸收，可以形成干擾，故本法不適用于烏靈膠囊中黃酮的含量測定。

2.1.3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法（C法）供試品溶液3.0 mL，置于25 mL容量瓶中。加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min；加 4%NaOH溶液10.0 mL，體積分數(shù)60%乙醇定容，搖勻。10 000 r/min離心20 min，在波長400～700 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在510 nm處有最大吸收峰。以相應(yīng)試劑為空白，在波長400～700 nm范圍內(nèi)掃描，510 nm附近未見吸收峰。

綜上，A、B 2種常用的總黃酮含量測定方法不適用于烏靈膠囊，C法較適合，確定測定波長為510 nm。

2.2 制作標準曲線

2.2.1 對照品溶液制備 準確稱取蘆丁標準品5.500 2 mg，用體積分數(shù)60%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，作為標準液備用。

2.2.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取蘆丁對照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中。加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加10%A1（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加4%NaOH溶液4 mL，再用體積分數(shù)60%乙醇液稀釋至刻度，搖勻。10 000 r/min離心20 min；置比色皿中，以沒有加蘆丁對照品溶液的其他試劑作空白參比。于510 nm處測吸光度（D），得回歸方程：Y=0.013 0 X-0.017 6，R2=0.999 7，表明在5.5 ～ 55 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Figure 1 Standard curve of rutin

2.3 提取條件考察 為系統(tǒng)考察乙醇提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)文獻資料[9，10]及實際情況，對首次提取條件進行優(yōu)選。選用乙醇濃度（A）、溶劑用量（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）作為考察因素，以測得的浸提取樣品中總黃酮含量（質(zhì)量分數(shù)）為考察指標，選用L9（34）正交表設(shè)計（注：烏靈膠囊中烏靈菌粉用量為10 g）。見表1、2。

從表2的直觀分析可知，4種因素對烏靈膠囊總黃酮提取結(jié)果影響大小依次為D＞B＞A＞C。3種因素的最佳組合為A3B2C3D2，因此，烏靈膠囊總黃酮的最優(yōu)提取條件為：在85℃水浴條件下，用體積分數(shù)90%乙醇100 mL水浴回流提取2 h。

2.4 測定

2.4.1 供試品溶液制備 精密稱取烏靈膠囊約3 g，加體積分數(shù)90%乙醇100 mL，先泡0.5 h，85℃水浴條件下回流提取2 h，抽濾。按同法再提取1次，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇至僅剩5～7 mL為止，置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)60%乙醇稀釋至刻度，得樣品液。

2.4.2 儀器精密度考察 取按“2.4.1”項供試品溶液的制備，制備供試品溶液。取同一份對照品溶液，按照“2.1.3”項顯色法進行顯色，連續(xù)6次測定吸光度，分別為0.167、0.167、0.167、0.166、0.166、0.166，相對標準偏差（sR）=0.329%，表明儀器精密度良好。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels for orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2The results for L9（34）orthogonal test

2.4.3 顯色穩(wěn)定性考察 取同一份對照品溶液，按照“2.1.3”項顯色法進行顯色，顯色后以10 000 r/min 離心 20 min 后于 0、10、20、30、40、50、60 min時測定吸光度，結(jié)果表明顯色后20～80 min吸光度穩(wěn)定。見表3。

2.4.4 重復(fù)性考察 精密稱取過60目烏靈膠囊內(nèi)容物3 g共6份，按“2.4.1”項供試品溶液制備方法制備，按照“2.1.3”項顯色法進行顯色，測定510 nm處吸光度并計算含量，平均含量為0.842 mg/g，sR為2.309%，說明該方法重復(fù)性良好。見表4。

2.4.5 加樣回收率考察 精密吸取2.5 mL烏靈膠囊內(nèi)容物提取液（含總黃酮0.075 mg）于10 mL容量瓶中，加入與樣品中總黃酮含量相等的蘆丁參照品。加0.3 mL 5%NaNO2，搖勻后靜置6 min；加0.3 mL Al（NO3）3，搖勻后靜置6 min；加4%NaOH4 mL搖勻后靜置6 min。加體積分數(shù)60%乙醇補足至刻度，1 000 r/min離心20 min。于510 nm處測定吸光度值，并求得其平均回收率為99.420%，sR為1.270%，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，紫外分光光度法測定總黃酮含量，方法可靠，定量準確。

表3 顯色穩(wěn)定性考察表Table 3 The stability results for color-developing system

表4 烏靈膠囊總黃酮含量測定重復(fù)性考察表Table 4 The repeatability results for determination of content of total flavonoids in Wuling Capsules

2.5 烏靈膠囊總黃酮含量測定 按照經(jīng)過研究確定的樣品提取方法、顯色方法、測定方法進行操作，對烏靈膠囊進行總黃酮含量測定，結(jié)果顯示：烏靈膠囊總黃酮質(zhì)量分數(shù)為1.021 mg/g。見表6。

2.6 烏靈膠囊內(nèi)容物培養(yǎng)基總黃酮含量測定 按照經(jīng)過研究確定的樣品提取方法、顯色方法、測定方法進行操作，對培養(yǎng)基進行總黃酮含量測定，結(jié)果顯示：總黃酮質(zhì)量分數(shù)為0.191 mg/g。見表7。

2.7 3批烏靈膠囊總黃酮含量測定 按照經(jīng)過研究確定的樣品提取方法、顯色方法、測定方法進行操作，對3個批次的烏靈膠囊進行總黃酮含量測定，實驗結(jié)果顯示：烏靈膠囊（20170707、20170708、20170709）總黃酮質(zhì)量分數(shù)分別為0.967、0.936、0.831 mg/g。見表8。

表5 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法的回收率試驗結(jié)果Table 5The test results for recovery rate by NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric assay

表6 烏靈膠囊總黃酮含量測定結(jié)果Table 6 The content of total flavonoids in Wuling Capsules

表7 烏靈膠囊內(nèi)容物培養(yǎng)基總黃酮含量測定結(jié)果Table 7 The content of total flavonoids in medium of Wuling Capsules

表8 3批烏靈膠囊總黃酮含量測定結(jié)果Table 8 The content of total flavonoids in 3 batches of Wuling Capsules

3 討論

黃酮類化合物普遍存在于植物中，以與糖結(jié)合為苷或游離態(tài)的方式存在，是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素，其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化和還原產(chǎn)物，也即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。根據(jù)三碳鍵（C3）結(jié)構(gòu)的氧化程度和B環(huán)的連接位置等特點，黃酮類化合物可分為下列幾類：黃酮和黃酮醇、二氫黃酮和黃烷酮醇二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮、二氫查耳酮、橙酮（又稱澳咔）、黃烷和黃烷醇、黃烷二醇（3，4）（又稱白花色苷元）。黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血糖、降血脂、提高免疫力等作用[11-15]。基于黃酮類化合物的這些廣泛作用，我們對烏靈膠囊中的總黃酮進行研究，通過開發(fā)其在補腎健腦、養(yǎng)心安神之外的其他功能，以增加烏靈膠囊的適應(yīng)癥，或?qū)⑵溟_發(fā)成為其他劑型的制劑。

本研究以烏靈膠囊中黃酮類化合物的提取率為指標，探討了乙醇濃度、提取時間、提取溫度和溶劑用量等4個因素對靈芝菌糠中黃酮類化合物提取率的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了L9（34）正交試驗以對提取工藝進行優(yōu)化。研究結(jié)果顯示，在乙醇濃度（90%）、溶劑用量、提取時間（2 h）、提取溫度（85℃）的條件下，烏靈膠囊中黃酮類化合物的提取率最高。

本研究應(yīng)用AlCl3顯色法、鹽酸—鎂粉顯色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法這3種紫外分光光度法在200～600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，AlCl3顯色法在350 nm處有最大吸收，但極不穩(wěn)定。鹽酸—鎂粉顯色法顯色后在285 nm處有最大吸收，但未顯色的供試品溶液、對照品溶液在280 nm處有吸收，可形成干擾，因此這2種方法均不可以用于烏靈膠囊中總黃酮的含量測定。而采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，蘆丁對照品和烏靈膠囊提取的總黃酮均在510 nm波長處有最大吸收。其基本原理為黃酮類化合物在中性或弱堿性條件下能夠與鋁鹽形成黃色絡(luò)合物，繼續(xù)加入氫氧化鈉會生成桔紅色有機物，在可見光區(qū)510 nm波長附近產(chǎn)生最大吸收[16]，從而為紫外分光光度法測定提供了可靠的依據(jù)。故本研究選擇該方法作為烏靈膠囊提取物中總黃酮含量的檢測方法，結(jié)果表明其方法可行、準確、簡捷，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可以用于烏靈膠囊中總黃酮的含量測定。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量時，必須嚴格保證稀釋定容用乙醇的濃度一定要準確，對試劑加入時間、顯色時間各步操作中每個樣品最好是平行進行，以確保測試環(huán)節(jié)前后完全一致，否則會出現(xiàn)很大誤差。

總黃酮含量測定的方法主要包括NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法[17]、AlCl3[18]顯色法和鹽酸—鎂粉[19，20]顯色法。由于當黃酮化合物的B環(huán)中不存在 3’，4’-鄰位二酚羥基的結(jié)構(gòu)時，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系是無法顯色的[21]。而本研究發(fā)現(xiàn)，烏靈膠囊中總黃酮是顯色的，因此可以推斷其總黃酮結(jié)構(gòu)中存在3’，4’-鄰位二酚羥基；而黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇均易在鹽酸—鎂粉作用下被還原，生成橙紅到紅紫色物質(zhì)，故推斷烏靈膠囊中總黃酮中并不含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇類物質(zhì)。AlCl3顯色法[22]反應(yīng)主要發(fā)生在3-羥基、4-羰基和鄰二酚羥基，只存在5-羥基、4-羰基的黃酮類物質(zhì)與AlCl3不發(fā)生反應(yīng)，由此推斷，烏靈膠囊總黃酮是5-羥基、4-羰基的黃酮類物質(zhì)。通過本研究可以為有目的地合成與烏靈膠囊總黃酮有關(guān)的黃酮類物提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基通過烏靈菌在一定條件進行發(fā)酵后，其產(chǎn)物中總黃酮含量是培養(yǎng)基中的5倍有余，這更進一步證明，烏靈膠囊中總黃酮是其產(chǎn)物藥效的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，對其研究還有待進一步深入。