補骨脂酚對去勢導致雄性小鼠骨質疏松的治療*

張盼陽 王昭昕 袁曉美 畢亞男 張 玥,2 周 昆,2

(1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193)(2.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 300193)

補骨脂，復方制劑壯骨關節丸中的一味組方中藥材，系豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaLinn.的干燥成熟果實，始載于《雷公炮炙論》，又名破故紙。其性溫，味辛、苦，用于補腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉。補骨脂中的主要活性成分有香豆素類、香豆酮苷、黃酮類化合物和單萜類[1-2]。補骨脂酚在補骨脂中含量達3%以上，研究表明其具有抗癌、抗抑郁、降糖降血脂等多種藥理活性[3-5]，補骨脂酚具有顯著的雌激素樣作用[6]，其在骨質疏松、圍絕經期綜合征等疾病的治療具有良好的應用前景[7]，劉穎等[8]實驗表明補骨脂藥渣對骨質疏松有良好的治療效果，且優于補骨脂生藥和水提物。但未見關于補骨脂酚對雄性骨質疏松療效的研究，故本文就補骨脂中含量較高成分的補骨脂酚對雄性小鼠抗骨質疏松效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 受試藥

補骨脂酚，經HPLC檢測純度大于95%，購于天津月牙湖科技有限公司。

1.2 動物

雄性ICR小鼠，56只，SPF級，體質量20～22 g，6周齡，購自于北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號SCXK(京)2014-0004)，飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心。自由攝食和飲水，飼料來自于北京科澳協力飼料有限公司，飼養環境：溫度20～25 ℃，濕度40%～60%。

1.3 試劑

阿侖膦酸鈉片，批號：J20130085，Merck Sharp & Dohme Italia Spa；

試劑盒：骨鈣素(OC)ELSIA，批號：L150401078，CUSABIO；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)試劑盒，批號：P032G-4，碧云天生物技術研究所；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒批號：140721，中生北控生物科技股份有限公司;注射用青霉素納，批號：017140656，中諾藥業(石家莊)有限公司產品；氯化鈉注射液，批號：141128,安徽雙鶴藥業責任有限公司產品;75%酒精，批號：141002，德州格利潔消毒制品有限公司產品；無水乙醇，批號：20150131，天津市科密歐化學試劑有限公司產品；水合氯醛，批號：20130705，天津市光復精細化工研究所產品；甲醛溶液，批號：20141204，天津市風船化學試劑科技有限公司產品。

1.4 儀器

JA1003電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；VivaCT40小動物活體斷層掃描儀(瑞士，SCANCO MEDICAL)；YLS-16A小動物骨骼強度測定儀(濟南益延科技發展有限公司)；7020全自動生化儀(日本，Hitachi)；EnSpire多模式微孔板檢測儀(美國，PerkinElmer)；Legend Micro 17 微量臺式離心機(Thermo)；RM2135轉輪切片機(德國，LEICA)；EG1150H包埋機(德國，LEICA)；CV5030全自動封片機(德國，LEICA)；ST5010全自動染色機(德國，LEICA)。

1.5 方法

1.5.1造模：小鼠進行適應性飼養2周后進行手術，術前12 h禁食，給藥組和模型組動物進行手術去勢，建立性激素缺乏的骨質疏松模型。腹腔注射5%水合氯醛(350 mg/kg體質量)進行麻醉，置仰臥式平鋪于手術臺，將小鼠睪丸從腹腔推入陰囊中，在陰囊部切約為1 cm的切口，把睪丸結扎并剪去，之后縫合傷口；對照組做剪去睪丸周圍一塊脂肪的假實驗。手術后，小鼠腹腔注射青霉素注射液5萬單位/只，連續3 d。

1.5.2分組及給藥：56只ICR小鼠隨機分為對照組Con(假手術)、去勢模型組Mod、陽性藥組AS(阿侖膦酸鈉20 mg/kg)和補骨脂酚組B10、B20(10 mg/kg和20 mg/kg) ，對照、模型和陽性藥組與“壯骨關節丸對小鼠骨質疏松的治療”實驗[9]共用。造模成功后飼養6周后給藥，補骨脂酚使用注射用油配制，腹腔注射給藥；阿侖膦酸鈉灌胃給藥，依據動物體質量給予藥物體積0.2 mL/10 g，每天給藥一次，連續8周，對照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。

1.5.3動物樣本處理：給藥8周后，取材。取材前12 h禁食不禁水，眼內眥取血，血樣放置離心管中，1 h后離心10 min，轉速3 000 r/min，吸取上清，貯存于-20 ℃冰箱中待測；取各組小鼠右腿脛骨，置于75%乙醇中3 d，每天換液，于第4天置于無水乙醇中保存用于骨密度檢測；取各組小鼠左腿脛骨放置于甲醛中保存待測；取各組小鼠雙腿股骨用于骨生物力學測定。

1.5.4血清生化指標的檢測：血清中TRACP按照試劑盒說明書進行檢測；Osteocalcin采用酶聯免疫雙抗夾心法進行檢測；ALP由全自動生化儀檢測而來。

1.5.5骨密度指標的檢測：使用VivaCT 40掃描右腿脛骨，進行三維骨密度分析。從脛骨近心端的骨垢線消失處開始、向遠心端進行掃描，每張厚度10.6 μm，取70張進行分析。指標為骨體積分數BV/TV、骨小梁數目Tb.N、骨小梁厚度Tb.Th、骨小梁分離度Tb.Sp和DA。

1.5.6骨最大荷載的檢測：小鼠股骨的最大荷載由YLS-16 A小動物骨骼強度測定儀檢測，最大荷載用Mode 1折斷模式檢測。

1.5.7病理學觀察：取左腿脛骨固定于10%甲醛溶液中，甲醛液固定的膝關節，經過8%的鹽酸和8%的甲酸混合液脫鈣后用LEICA EG1150H包埋機石蠟包埋，用RM2135轉輪切片機進行5 nm切片，H & E染色，光鏡下對骨關節進行病理組織學評價。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 對血清生化指標的影響

與對照組相比，模型組骨鈣素OC值顯著升高，B10、B20劑量組與模型組相比顯著下降；小鼠的ALP、TRACP和ALP/TRACP各組間的值無顯著性差異性，見表1。

表1 給藥8周去勢小鼠血清生化指標Table 1 Serum biochemical indicators of castrated mice at 8 weeks of

注：與對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01

Note: compared with control group,#P<0.05; compared with model group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 對骨密度相關指標的影響

CT掃描的3D結構顯示，模型組動物的骨小梁明顯減少、斷裂較多、間隙較大，而經過給藥治療之后骨小梁數量有了明顯增加，見圖1。

圖1 小鼠骨CT掃描典型圖片注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組Fig.1 Typical picture of mouse bone CT scanNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups

相比對照組，小鼠模型組相對骨體積和骨小梁數量顯著性降低，骨小梁厚度和分離度顯著升高；給藥后，各給藥組與模型組相比骨小梁數量顯著升高，陽性藥組和B20組骨小梁分離度和各向異性的程度顯著降低，陽性藥組骨小梁厚度顯著性降低，見表2。

表2 給藥8周去勢小鼠骨密度相關指標Table 2 Correlation index of bone mineral density in ovariectomized mice at 8

注：與對照組相比，#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

Note: compared with control group,#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001; compared with model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 對骨最大荷載的影響

與對照組相比，模型組小鼠脛骨的最大荷載能力明顯降低(P<0.01)。經過8周給藥治療后，各給藥組較模型組相比，脛骨最大荷載均顯著增高，見圖2。

圖2 給藥后雄小鼠的骨最大荷載注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組，與對照組相比， ## P<0.01； 與模型組相比， **P<0.01,***P<0.001Fig.2 Maximum bone load of male mice after administrationNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups.compared with control group, ## P<0.01; compared with model group,**P<0.01,***P<0.001

2.4 骨組織學檢測

如圖3，對照組動物脛骨上端骺板軟骨細胞柱狀排列整齊，無軟骨細胞壞死區存在，骨小梁形成較多，粗壯、飽滿，壁較厚，形態結構完整，排列緊密有序呈網狀，密度、面積正常，間隙較小。模型組動物骨小梁數目明顯減少，呈團塊狀，骨小梁間隙增大，關節面骺板下過渡骨小梁數目減少，其余未見明顯變化。給藥后，陽性藥補骨脂酚治療組與模型組相比，各組骨小梁數目均有所增多，膜下生骨增多，骨小梁間隙減小。

圖3 雄性小鼠典型脛骨病理圖片注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組Fig.3 Typical tibia pathology pictures of male miceNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups.

3 討論

骨質疏松癥是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病。 目前大多使用雌性動物進行骨質疏松研究，忽視了男性骨質疏松的研究，但是隨著人口老齡化，男性性腺功能減退，雄激素分泌減少，65歲以上的男性普遍存在程度不等的骨質疏松，病情的嚴重性和骨折后死亡率高于女性。骨組織對性激素很敏感，男性體內的睪酮主要來自于睪丸，故本實驗采用將睪丸切除，建立雄性小鼠骨質疏松模型[10]。

雙磷酸鹽類是臨床上應用廣泛的抗骨質疏松癥藥物，但隨著雙磷酸鹽類藥物抑制破骨細胞時間的延長，造骨細胞也會受到影響，可能導致下頜骨壞死、腎臟毒性等副作用。而中藥有著多年的臨床應用，相對安全性較好，因此從中藥中尋找抗骨質疏松有效成分是一個可行的途徑。本研究表明，補骨脂酚對于去勢導致的雄性小鼠骨質疏松有較好治療作用，提示其可以作為男性骨質疏松治療的潛在有效化合物，進而作為候選化合物進行后續優化和開發研究。