黃皮葉綠體基因組測序與分析

趙志常 高愛平 黃建峰 羅睿雄

摘要 [目的] 分析黃皮[Clausena lansium （Lour.）Skeels）]葉綠體基因組，為黃皮屬不同種或品種的進化、雜交、演變，以及黃皮不同品種的鑒定等提供技術支持。[方法]使用試劑盒提取了黃皮的葉綠體DNA，通過測序、組裝、注釋獲得了黃皮葉綠體基因組。[結果]黃皮葉綠體基因組全長159 283 bp，其中反相重復序列區（IRs）長53 998 bp，大單拷貝序列區（LSC）和小單拷貝序列區（SSC）長度分別為87 301、 17 983 bp，共注釋126個基因，包括編碼蛋白基因89個，tRNA基因29個和rRNA 基因8個。黃皮葉綠體基因組全序列GC含量387%。對5種蕓香科果樹的全長序列、SSC、LSC、 IRA、 IRB進行比較分析發現，假黃皮的葉綠體全長序列、LSC、IRA 、IRB區域的長度較其他4種果樹長，檸檬的SSC區域長度最長，黃皮的全長序列和SSC區域長度最短。黃皮葉綠體的基因數目和編碼蛋白數目較其他4種果樹多。對20種園藝植物的葉綠體基因組進行分析發現，同一科下面的不同屬植物或同一屬下面的不同種更容易聚為一類。[結論]該研究豐富了熱帶果樹的葉綠體基因組數據庫，為種質資源的合理開發利用提供了依據。

關鍵詞 黃皮;葉綠體基因組;測序與分析

中圖分類號 S667.9文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0115-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective] The analysis of the chloroplast genome of Clausena lansium （Lour.）Skeels provides technical support for the evolution， hybridization and evolution of different species or varieties of Clausena lansium， as well as the identification of different varieties of Clausena lansium.[Method] The chloroplast DNA was extracted from Clausena lansium by kit， and chloroplast genome was obtained by sequencing， assembly and annotation. [Result] The chloroplast genome is 159 283 bp in length， of which the inverted repeats sequence （IRs） is 53 998 bp， the large singlecopy region（LSC） and the small single copy region （SSC） are 87 301 and 17 983 bp， respectively. A total of 126 genes are annotated， including 89 coding protein genes， 29 tRNA genes and 8 rRNA genes.The fullsequence GC content of the chloroplast genome was 38.7%. The fulllength sequences， SSC， LSC， IRA and IRB of five Rutaceae fruit trees， were compared and analyzed. It was found that the chloroplast fulllength sequences， LSC， IRA and IRB regions of Clausena excavata were longer than those of the other four fruit trees， and the Citrus limon in SSC region was the longest and the Clausena lansium? was the shortest.And the whole length sequence of Clausena lansium? is also the shortest among the five species.The number of genes and coding proteins of chloroplasts in Clausena lansium? was more than that in other four fruit trees. Analysis of the chloroplast genomes of 20 horticultural plants revealed that different genus plants under the same family or different species under the same genus were more likely to be clustered into one group.[Conclusion]This study enriched the chloroplast genome database of tropical fruit trees and provided a basis for the rational development and utilization of germplasm resources.

Key words Clausena lansium （Lour.）Skeels;Chloroplast genome;Sequencing and analysis

基金項目 國家自然科學基金資助項目（31471850）;國家重點研發計劃（2018YFD1000500）;非營利性科研機構改革啟動經費（1630032017005;1630032017004）。

作者簡介 趙志常（1977—），男，山東煙臺人，副研究員，從事熱帶果樹遺傳育種與分子生物學研究。*通信作者，研究員，從事果樹資源學方面研究。

收稿日期 2019-01-14

葉綠體是光合作用的重要細胞器，探討葉綠體各部分的功能以及在生物進化中的系統關系及作用，對研究作物改良、提高光合效率、探索細胞器的起源和進化具有重要意義。全面分析葉綠體基因組序列是做好這些工作的前提。葉綠體基因組研究不僅有助于通過遺傳轉化體系改良葉綠體功能，選育出有價值的新品種，而且可以在分子水平上揭示光合作用機理、核質互作關系以及物種起源與進化。1986年Shi-nozaki等[1]獲得煙草葉綠體基因組全序列，開啟了葉綠體基因組測序的先河。目前，葉綠體基因組數據庫正在迅速充實，到2018年1月NCBI中已收集了來自不同植物的4 000多條葉綠體基因組全序列，以及一些果樹植物的部分葉綠體基因組或某些基因的序列，其中包含同一個種的不同亞種和同一個種的不同栽培品種的葉綠體基因組全序列。葉綠體基因組非常保守，主要表現在基因組結構、基因排列順序和基因種類等方面。在高等植物中，葉綠體DNA以共價、閉合、環形雙鏈DNA的多拷貝形式存在，大小一般在120～160 kb，因此具有單親遺傳，小分子量、多拷貝、分子進化速率慢等特點[2-4]。葉綠體DNA序列已被廣泛應用于分子系統發育研究中。該研究以黃皮葉綠體基因組原始測序數據結果為基礎，進一步對黃皮葉綠體全基因組序列進行注釋、校正，再將其與蕓香科的4種植物葉綠體基因組進行比較，并對20種園藝植物的葉綠體基因序列進行聚類分析，以期對黃皮不同品種的鑒定以及種質資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮的黃皮葉片取中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所黃皮種質資源圃，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 研究方法

1.2.1 黃皮葉綠體基因組DNA 的提取與組裝。利用天根公司的植物DNA提取試劑盒提取黃皮葉片的總DNA。 DNA 構建 300 bp 的文庫，在 Illumina 測序平臺，總測序深度約為 129X，測序得到約 39 G 的數據，對原始數據進行過濾低質量和PCR 復制等處理后，得到高質量的數據，使用 SOAPdenovo 軟件對高質量數據進行組裝，并以假黃皮的序列作為參考。采用OGDRAW軟件（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/）生成葉綠體基因組的物理圖譜[5]。

1.2.2 葉綠體基因組的特征分析及系統進化分析。對照NCBI上已經登錄甜橙（DQ864733）、假黃皮（NC_032685）、檸檬（KJ865401）、山小橘（KU949005）4種植物的葉綠體基因組序列，進行5種果樹的葉綠體基因組的比較。根據NCBI上已經登錄植物的葉綠體基因組序列共選取了20個主要園藝植物的葉綠體基因組序列，利用BioEdit軟件對各物種的10 000個核苷酸序列利用近鄰系統發育樹分析[6-7]。

2 結果與分析

2.1 黃皮葉綠體全基因組結構及特征

結果表明，黃皮葉綠體基因組呈環狀雙鏈。與大多數高等植物葉綠體基因組一樣，存在 2 個反向重復序列（Inverted repeat，IR），即 IRA 和 IRB;反向重復序列之間有一個大單拷貝區（Large single-copy region，LSC）和一個小單拷貝區（Small single-copy region，SSC）。黃皮葉綠體基因組全長159 283 bp，其中反相重復序列區（IRs）長53 998 bp，大單拷貝序列區（LSC）和小單拷貝序列區（SSC）長度分別為87 301、17 983 bp，共注釋126個基因，包括編碼蛋白基因89個，tRNA 基因29個和rRNA 基因8個（圖1）。在全基因組中，A+T含量為61.4%、G+C含量為38.6%，在SSC中A+T含量為66.6%、G+C含量為33.4%，LSC中A+T含量為62.9%，G+C含量為37.1%，IRA中A+T含量為57.0%，G+C含量為43.0%，IRB中A+T含量為57.1%，G+C含量為42.9%（表1）。

47卷11期 趙志常等 黃皮葉綠體基因組測序與分析

2.2 5種蕓香科葉綠體基因組比較

對NCBI上已經登錄的假黃皮葉綠體基因組序列進行分析發現，其全長161 171 bp，反向重復區（IRA和IRB，27 411bp）、小單拷貝區（SSC，18 029 bp）、大單拷貝區（LSC，88 055 bp），其葉綠體基因組有113個基因、80個編碼蛋白質基因、30個轉運RNA基因和4個核糖體RNA基因。甜橙葉綠體全基因組長160 129 bp，大單拷貝區（LSC，87 744 bp）、小單拷貝區（SSC，18 393 bp）、反向重復區（IRA和IRB，26 991 bp），其葉綠體基因組有113個基因、79個編碼蛋白質基因、30個轉運RNA基因和4個核糖體RNA基因。檸檬葉綠體全基因組長159 893 bp，大單拷貝區（LSC，87 148 bp）、小單拷貝區（SSC，18 763 bp）、反向重復區（IRA和IRB，26 991 bp），其葉綠體基因組有115個基因、81個編碼蛋白質基因、30個轉運RNA基因和4個核糖體RNA基因。山小橘葉綠體全基因組長159 844 bp，大單拷貝區（LSC，87 494 bp）、小單拷貝區（SSC，18 332 bp）、反向重復區（IRA和IRB，27 009 bp），其葉綠體基因組有117個基因、83個編碼蛋白質基因、30個轉運RNA基因和4個核糖體RNA基因。對5種熱帶果樹的全長序列、SSC、LSC、 IRA、 IRB進行比較分析發現，假黃皮的葉綠體全長序列、LSC、IRA、IRB區域的長度較其他4種果樹長，SSC區檸檬的最長，黃皮的最短。并且黃皮的全長序列也是5種植物中最短的。黃皮葉綠體的基因數目和編碼蛋白數目較其他4種果樹多。作為蕓香科的假黃皮和黃皮兩者在tRNA和 rRNA的數目上均有差異。

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P80的同源性為97.3%。該試驗結果表明，即使接種疫苗，仔豬依然存在PRRSV持續性感染狀況。我國現有的商業化PRRSV弱毒疫苗能否有效預防HP-PRRSV，尚有待進一步研究。