柑橘銹螨為害‘沃柑’果皮的結構變化和揮發油成分分析*

田 帥，譚夢超，韋 維，楊 娟，劉慧勤，黃桂香，王國全

（1 植物科學國家級實驗教學示范中心，廣西大學農學院，南寧 530005）

（2 南寧師范大學地理與海洋研究院）

（3 廣西壯族自治區林業科學研究院）

（4 廣西大學輕工與食品工程學院）

柑橘類種質資源在我國分布廣泛，總產量在我國眾多水果中位居首位，深受人們喜愛。柑橘類果皮中富含黃酮類化合物、類胡蘿卜素、精油、纖維素等多種有益成分，其中柑橘精油用途最廣泛[1-5]。柑橘精油具有很好的保鮮、抗氧化、抑菌等特點，主要應用于天然香料、食品保鮮、化妝品等行業[6-12]。‘沃柑’是‘坦普爾’橘橙和‘丹西’紅橘的雜交品種，因具有外觀好、晚熟、豐產、品質優等特點，是廣西近年發展速度最快的柑橘品種，但該品種果實受銹螨危害易發生黑皮果。

柑橘銹螨，即柑橘皺葉刺癭螨［Phyllocoptruta oleivora（Ashmead）］，又稱柑橘銹壁虱，是世界性柑橘害螨。柑橘銹螨體型微小、繁殖快，隨風力、昆蟲、器械等途徑傳播蔓延[13-14]。目前，關于柑橘銹螨的研究主要集中于形態特征[15-16]、生物學[17-20]、發生規律[21-22]、防治措施[23-27]等方面。柑橘銹螨主要為害柑橘的幼芽、枝葉、果實等各個部位[28-31]。在果實發育期，柑橘銹螨成螨、若螨將自身口器刺入柑橘果實中吸取汁液，柑橘果實油細胞受到損傷產生破裂，形成黑皮果[32-34]，也稱為“油皮坨”“油皮柑”。目前，柑橘銹螨危害形成黑皮果僅限于果實品質方面的研究，測定了黑皮果的可溶性固形物、糖酸比、維生素C 含量等生理指標[35-36]。本試驗以‘沃柑’正常果和銹螨為害果為試驗材料，研究了柑橘銹螨對‘沃柑’果皮的微觀結構和揮發油成分2 個方面的影響，以期為全面分析柑橘銹螨的危害機理提供新的研究思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘沃柑’果實于2019 年10 月7 日采自廣西大學標本園，分別采摘正常‘沃柑’果實和銹螨為害果實，用蒸餾水沖洗干凈，迅速收集果皮放入液氮中運回實驗室，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 儀器與藥品

超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司，DW-86L338J 型號）、冷凍干燥機（德國CHRIST公司，ALPHAL-4 LD PLUS 型號）、掃描電鏡（荷蘭PHENOM 公司，F16502 型號）、高精度恒溫水槽（THCY-18Q）、手動進樣手柄（SPME）、萃取頭（50-30UM DVB-CVR on PDMS 萃取）、氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司，TQ8040 型號）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 電鏡樣品前處理

取超低溫冰箱中的果皮（長5 mm、厚3 mm），迅速轉移到低溫冷凍干燥機干燥24 h，用雙面導電膠將干燥后的果皮樣品粘貼在樣品臺上，噴金處理后進行掃描電鏡觀察拍照。

1.3.2 揮發油成分樣品前處理

先將果皮粉碎，迅速取0.5 g 樣品裝入樣品瓶中，再將萃取頭插入進樣口于250 ℃老化2 min，老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，推出纖維頭，80 ℃條件下恒溫磁力攪拌吸附1 h，然后從樣品瓶上拔出萃取頭，插入設置好條件的GC-MS 進樣口，250 ℃條件下解析2 min 開始采集數據。

1.4 色譜和質譜條件

色譜條件：色譜柱（DB-5MS，30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，色譜柱起始溫度50 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min 的速率上升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持10 min。載氣（氦氣），流速1.0 mL/min。

質譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，離子化方式SIM，電子能量70 eV，掃描質量范圍45～600 m/z。

通過NIST14.lib 標準譜庫檢索確定成分種類，采用面積歸一法計算各成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡結果分析

由圖1、圖2 可以看出，‘沃柑’正常果皮表面整體呈平滑狀，局部具有柑橘類果皮特有的皺褶，氣孔完整，視野內未觀察到角質層損傷，結構保持完整；柑橘銹螨為害果皮角質層出現明顯龜裂，裂縫無固定方向，結構完整性受到嚴重破壞。

圖1 ‘沃柑’正常果皮電鏡圖

圖2 銹螨為害‘沃柑’果皮電鏡圖

2.2 揮發性成分結果分析

由表1 可知，‘沃柑’正常果皮共檢測出來75種成分，占總峰面積的81.60%，萜烯烴類、酯類、醇類為主要成分，含量較高的成分有檸檬烯（52.26%）、月桂烯（5.25%）、2-蒎烯（1.75%）、芳樟醇（1.33%）、棕櫚酸甲酯（1.20%）等。銹螨為害果皮共檢測出來79 種成分，占總峰面積的72.87%，萜烯烴類、酯類、醇類為主要成分，含量較高的成分有檸檬烯（44.17%）、月桂烯（5.16%）、2-蒎烯（1.82%）、α-衣蘭油烯（1.21%）、棕櫚酸甲酯（1.17%）等。

‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮共有相同成分54 種，其中檸檬烯含量均最高，‘沃柑’正常果皮中含量為52.26%，銹螨為害果皮中含量為44.17%（表1），與前人測定的柑橘類品種基本一致[37-38]。月桂烯的含量僅次于檸檬烯，其具有香油和天竺葵的特有香味。芳樟醇是柑橘香氣的主要成分之一，具有特殊的花香味[39-41]。酯類、醛類、酮類等都是柑橘果皮揮發油中重要的香味成分，使果實散發出特有的芳香味[42-43]。

‘沃柑’正常果皮特有的成分有21 種（表1），其中特有的青葉醛和共有的香茅醛是主要的脂肪類香氣，具有特殊的香味，可用于高級香料和精油的調制[44]。‘沃柑’果實受銹螨危害后產生了25 種特有的成分，有研究證實[45]，角鯊烯可參與清除果實內部的自由基，并提高氧負荷，可以起到很好的保鮮作用。

表1 ‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮揮發油GC-MS 分析結果

續表1

續表1

由表2 分析得出，‘沃柑’受柑橘銹螨危害后，果皮醇類、萜烯烴類、醛類、酮類、酚類的含量降低，酯類、烷烴類、酸類、醚類的含量上升。‘沃柑’正常果皮揮發油成分有8 類，分別為醇類（6.94%）、萜烯烴類（65.89%）、酯類（3.59%）、醛類（2.89%）、酮類（0.58%）、酚類（0.29%）、烷烴類（1.02%）、酸類（0.40%），分別包含了20、19、15、8、4、3、3、3 種成分。柑橘銹螨為害果皮揮發油成分有9 類，分別為醇類（3.59%）、萜烯烴類（59.86%）、酯類（4.04%）、醛類（2.61%）、酮類（0.33%）、酚類（0.03%）、烷烴類（1.58%）、酸類（0.76%）、醚類（0.07%），分別包含了18、21、18、8、2、1、7、3、1 種成分。

表2 ‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮揮發油成分的種類及相對含量

3 討論與結論

柑橘銹螨為害果實誘發黑皮果，導致果型變小、果囊硬實、色澤和可口性變差，嚴重降低了果實品質。本研究重點討論了銹螨為害后‘沃柑’果皮的微觀結構和揮發油成分變化，證實了柑橘銹螨為害果實會引發果皮角質層結構破壞。果皮最外側覆蓋著一層疏水性脂質結構——角質層，是一種復合的、異質分布的生物聚合物，主要參與蒸騰作用、氣體交換、親酯物質運輸等生理生化反應的調控，同時具有保持果實表面潔凈、防止微生物和昆蟲侵染等多種功能[46-56]。外源物的刺激會引起柑橘果皮角質層的成分和結構發生改變，而角質層結構和成分的異常改變與果實正常膨大發育之間的不協調，最終會引起果皮呈現大面積褐斑和果實內部生理紊亂，進而影響果實品質[57-60]。結合之前相關學者對柑橘角質層的研究結論對比分析得出，柑橘銹螨為害‘沃柑’果實會引起果皮角質層出現大面積龜裂，破壞果皮角質層正常結構，影響果實內部膨大發育和正常生理反應，從一定程度上可以解釋柑橘黑皮果果型較小、色澤度和口感差的形成機理。

柑橘表皮角質層主要由脂肪族化合物和萜類化合物等組分構成，脂肪族化合物主要為C23～C33醛、C20～C31初級醇、C16～C34偶數碳原子鏈飽和脂肪酸、C18∶1、C18∶2不飽和脂肪酸和C21～C33奇數碳原子鏈烷烴，其中C24、C26、C28是主要的醛類物質，C29和C31在烷烴中占據著主要地位，部分柑橘角質層還檢測到次級代謝物——微量膽固醇和酮類物質[58,61-62]。研究表明，環境改變和外源刺激會導致角質層組分發生改變，影響化合物的合成途徑[63-64]。由此分析本試驗中柑橘銹螨為害‘沃柑’果實引起醇類、萜烯烴類等物質含量的下降和酯類、烷烴類等物質含量的上升，根本原因是角質層中相應的生化反應途徑受到柑橘銹螨危害刺激后發生了改變，引發了不同組分之間的相互轉變。柑橘角質層的研究在生物合成、成分變化、形態結構等方面雖取得一定進展，但是存在成分研究具有偏好性，研究方向集中在含量和組分、種類方面，深層機理和多種功能相關性驗證研究較少[65-67]。鑒于目前技術水平和相關機理研究的缺乏，試驗數據尚不能很好地揭示揮發油成分種類及含量變化的生化反應途徑機理。

柑橘銹螨危害形成黑皮果機理研究方面，明確相關侵染機制、角質層防御機制、果實內部的生理生化防御機制、分子水平的防御機制和反應通路顯得尤其重要。由于柑橘種質資源眾多，不同品種對柑橘銹螨的抗性不同，未來可以根據分子水平上的防御機制選育對柑橘銹螨具有特定抗性基因的優良品種，最終從根源上降低柑橘銹螨危害，提高柑橘果實品質。鑒于柑橘眾多品種之間親緣關系復雜，柑橘銹螨對不同柑橘品種的侵染機制，以及不同品種對柑橘銹螨的抗性機制是否會存在較大差異，仍有待于進一步的研究。