食品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質同時檢測方法的建立

孔凡華,張一凡,郭 倩,李菁菁,趙 禎,木其爾,田榮榮,崔亞娟,*

(1.北京市營養源研究所,北京市系統營養工程技術研究中心,北京 100069;2.北京城市學院生物醫藥學部,北京 100083)

類胡蘿素是一類廣泛存在于植物、真菌、藻類和細菌中的黃色、橙紅色或紅色色素,目前在自然界已經鑒定出來700多種[1]。其中葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質等為當前廣受關注的典型類胡蘿素,主要存在于天然果蔬中[2],在人體健康中扮演了重要的角色,具有很多生理功能[3]。如葉黃素、玉米黃質具有較強抗氧化性[4],能夠清除自由基的影響,提高免疫功能,減少患慢性病[5]、癌癥[6]等的風險,可以預防和治療糖尿病[7],有效減少藍光對視網膜的傷害,預防年齡相關性黃斑變性等病癥[8]。葉黃素已經廣泛應用于醫藥、保健品、食品、化妝品、飼料等領域[9]。

葉黃素的分析檢測方法主要有:紫外-可見分光光度法[10-11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-13]、液相色譜質譜聯用法[14-15]、紅外光譜法[16-17]、超臨界流體色譜法[18-19]、核磁共振法[20-21]等,在我國現行的國家標準中,葉黃素的分析方法為液相色譜法[22]。高效液相色譜法具有分離效果好、選擇靈敏性強、分離速度快、可與多種技術聯用等優點,是目前使用最廣泛的對葉黃素進行定量分析的檢測方法,也是定量分析玉米黃質和β-隱黃質的常用方法。

葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的提取方法有:室溫皂化提取[23]、溫水浴提取[24]、超聲提取[24-25]、、冷丙酮提取[26]等,在提取過程中,葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質很容易發生氧化和結構異化,有必要建立快速溫和的提取方法,對其進行更精確的定量。葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質共同存在于食品基質中,但同時將其分離和定量的相關研究較少。因此,建立食品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質同時檢測技術具有重要的現實意義。本文在借鑒前人研究的基礎上,利用高效液相色譜法建立了食品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的同時在線分析檢測方法,以小米和大米為樣品進行方法學驗證,采用建立的方法對不同食品基質菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋樣品進行葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的含量測定,旨在為科研和實際應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小米、菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋等樣品 市購;葉黃素標準品(純度≥97.0%)、玉米黃素標準品(純度≥95.0%)、β-隱黃質標準品(純度≥97.0%)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 美國Sigma公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯(均為色譜純) 美國Fisher公司;無水硫酸鈉、乙醇、正己烷、環己烷、異丙醇、氫氧化鉀、石油醚、抗壞血酸(均為分析純) 北京化工廠;無水乙醚 國藥集團化學試劑有限公司。

BS224S分析天平 德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司;EYELA N-1100旋轉蒸發儀 東京理化株式會社;Thermo U-3000高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇 準確稱取5份2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 50%氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內,避光振蕩皂化30 min,取出立即冷卻至室溫。將5份皂化液分別用50 mL水轉入250 mL分液漏斗中,每份樣品加入一種提取溶劑,這5種溶劑分別是:50 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液、50 mL正己烷∶乙酸乙酯(7∶3)混合液、50 mL環己烷∶乙酸乙酯(2∶8)混合液、50 mL正己烷∶異丙醇(3∶1)混合液、50 mL環己烷∶乙酸乙酯(1∶1)混合液,振蕩萃取5 min,將下層溶液轉移至另一250 mL分液漏斗中,分別加入50 mL上述萃取溶劑重復萃取,每次用約100 mL水洗滌萃取溶劑層,重復洗滌3次,直至將萃取溶劑層洗至中性,去除下層水相。合并兩次洗滌后的萃取溶劑層,經無水硫酸鈉濾入150 mL旋轉蒸發瓶內,用約15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次,并入蒸發瓶內,將蒸發瓶接在旋轉蒸發儀上,40 ℃水浴減壓蒸餾,待瓶中萃取液剩下約2 mL時,取下蒸發瓶,立即用氮氣吹至近干。用2 mL含0.1% BHT的乙醇溶液定容。溶液過0.45 μm有機系濾膜后,按下述高效液相色譜條件測定。

1.2.2 前處理條件的選擇

1.2.2.1 堿溶液的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液,分別加入10 mL 10%氫氧化鉀水溶液、10 mL 20%氫氧化鉀水溶液、10 mL 50%氧化鉀水溶液、10 mL 60%氫氧化鉀水溶液、10 mL 10%氫氧化鉀甲醇溶液、10 mL 30%氫氧化鉀甲醇溶液混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內,避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻至室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.2.2 皂化溫度的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,于25、50、75 ℃恒溫振蕩水浴鍋內避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻到室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.2.3 皂化時間的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內,避光振蕩皂化5、10、15、30、45和60 min,取出立即冷卻至室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)其他操作步驟同1.2.1。

1.2.3 不同前處理方法比較研究

1.2.3.1 國標方法 準確稱取2.0 g均勻小米于50 mL離心管中,以10 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液萃取溶劑,避光渦旋振蕩提取3 min,4500 r/min離心3 min,重復提取2次,合并提取液,于室溫減壓濃縮至近干,以3 mL萃取溶劑渦旋振蕩溶解,重復操作1次,合并萃取溶劑,混勻,以約1 mL/min的流速過已活化的中性氧化鋁固相萃取小柱,用3 mL萃取溶劑洗脫,合并流出液與洗脫液,于室溫減壓濃縮至近干,以0.1% BHT乙醇溶液,渦旋振蕩溶解殘渣并定容至10 mL,過0.45 μm濾膜,供液相色譜測定。

1.2.3.2 超聲提取方法 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,混勻。常溫避光超聲提取30 min,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.3.3 實驗建立方法 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻到室溫,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.4 方法學驗證實驗

1.2.4.1 標準曲線的繪制 準確稱取葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質標準品1 mg(精確到0.1 mg),用丙酮定容至25 mL棕色容量瓶中,臨用前在波長445 nm處用丙酮作空白于分光光度計上標定溶液濃度。

準確吸取葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質標準儲備溶液,配制成不同濃度梯度的葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質標準溶液,以濃度為縱坐標,峰面積為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.4.2 方法精密度實驗 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60% 氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻至室溫,其他操作步驟同1.2.1,連續測定6次(n=6),驗證方法的精密度。

1.2.4.3 方法準確度實驗 取大米樣品,測定樣品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質含量,結果均小于檢出限,以大米為空白樣品,進行三個標準添加水平的回收率試驗,每個添加水平重復測定3次,分別計算加標回收率和相對標準偏差。

1.2.5 色譜條件 色譜柱:YMC C30(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為二氯甲烷∶乙腈∶甲醇(2∶3∶5);檢測波長:445 nm;柱溫:30 ℃;進樣體積:20 μL。

1.2.6 含量的測定 葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質含量按下式測定:

式中:X為樣品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的提取量,μg/100 g;c為由標準曲線而得的試樣溶液中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的濃度,μg/mL;V為試樣溶液最終定容體積,mL;m為試樣質量,g。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優化

由于溶劑的極性差異、皂化液與各種提取劑的互溶性及分散狀況不同,不同萃取液對葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的溶解能力不同。強極性溶劑與弱極性溶劑混合后溶液的極性更容易與葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的極性接近,進而溶解更多的葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質,所以,混合溶劑比單溶劑對葉黃素的提取效果更好[27]。由表1知,小米中未檢測到β-隱黃質;正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液對小米中葉黃素和玉米黃質的萃取效果最佳,故選擇正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液作為實驗提取溶劑。

表1 不同提取溶劑測定結果

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 堿溶液的優化 由表2可知,隨堿濃度的增加,葉黃素和玉米黃質的含量呈現遞增趨勢;當堿溶液濃度小于 60%時,葉黃素酯分散性不好,影響皂化反應進行,使葉黃素含量低;當堿溶液濃度為60%時,葉黃素的含量達到最大值,故選擇60%氫氧化鉀水溶液作為實驗皂化溶液。

表2 不同堿溶液皂化測定結果

2.2.2 皂化溫度的優化 由圖1可知,25 ℃皂化后葉黃素和玉米黃質的含量小于50 ℃,這是因為溫度升高,可以加快葉黃素酯轉化成游離葉黃素的效率。隨著溫度的升高,葉黃素和玉米黃質的含量減少,這是由于皂化溫度過高會導致葉黃素和玉米黃質的分解。因此,皂化溫度控制在50 ℃為宜。

圖1 不同皂化溫度測定結果

2.2.3 皂化時間的優化 由圖2可知,5～5 min之內隨著皂化時間的延長,體系中葉黃素和玉米黃質的含量逐漸升高,在15 min時葉黃素含量達到最高,在15 min后葉黃素含量下降。說明15 min后,皂化反應生成葉黃素和玉米黃質的速度小于葉黃素和玉米黃質的降解速度。所以,皂化時間選擇15 min最佳。

圖2 不同皂化時間測定結果

2.3 不同前處理方法比較研究

由圖3可知,實驗建立的方法葉黃素提取率比超聲方法提高3.81%,比國標方法提高24.74%;玉米黃質提取率比超聲方法提高0.78%,比國標方法提高11.08%?？梢?實驗建立的方法可以實現葉黃素、玉米黃質的快速溫和提取,對天然食品基質中葉黃素和玉米黃質的提取效果優于超聲提取方法和國標方法。

圖3 不同前處理方法測定結果

2.4 方法學驗證實驗

2.4.1 標準曲線的繪制 由圖4可知,葉黃素在0.2342～9.3689 μg/mL范圍內線性關系良好,線性回歸方程為Y=3.8333x,相關系數R2=0.9999;玉米黃質在0.3004～12.0167 μg/mL范圍內線性關系良好,線性回歸方程為Y=4.7156x,相關系數R2=0.9999;β-隱黃質在0.3734～14.9371 μg/mL范圍內線性關系良好,線性回歸方程為Y=3.7526x,相關系數R2=0.9996。葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質高效液相色譜圖見圖5。

圖4 標準曲線繪制

圖5 葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質標準譜圖

2.4.2 方法精密度實驗 由表3可知,平行測定6次,RSD均小于10%,表明方法的精密度良好,適合定量分析。

表3 方法精密度結果

2.4.3 方法準確度實驗 由表4可知,葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質加標回收率在85.6%～98.8%之間，平均加標回收率分別為90.3%、91.7%、90.5%,加標回收率的相對標準偏差分別為4.51%、7.60%、5.84%。能夠滿足檢測實際樣品的檢測需要。

表4 加標回收率實驗結果

2.5 食品中葉黃素含量的測定

選擇菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋等葉黃素含量較高的天然食品基質,用本實驗建立的方法測定食品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的含量,結果見表5。

表5 不同食品中葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的含量

由表5可知,菊花中葉黃素含量最高,菠菜中次之,菠菜和玉米中玉米黃質含量較高,橙子和玉米中β-隱黃質含量較高。

3 結論

本實驗優化了葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質的前處理條件,最終確定最優前處理條件為:試樣中加入30 mL含0.1%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,置于恒溫水浴箱內50 ℃振蕩皂化15 min,處理樣液用100 mL正己烷∶乙醚∶環己烷(2∶2∶1)混合液萃取。平行測定6次,葉黃素、玉米黃質的相對標準偏差(RSD)分別為1.41%、4.98%,加標回收率在85.6%～98.8%之間,表明該方法重現性良好、準確可行。本實驗采用等度洗脫,12 min之內,葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質出峰完全并得到較好的峰型,與國標方法和文獻報道的梯度洗脫方法相比,色譜條件簡單,易于操作,同時,縮短了分析時間,節約成本。

實驗建立的方法葉黃素提取率比超聲方法提高3.81%,比國標方法提高24.74%;玉米黃質提取率比超聲方法提高0.78%,比國標方法提高11.08%?？梢?實驗建立的方法對葉黃素、玉米黃質的提取效率更高,可以更加準確定量食品中葉黃素、玉米黃質的含量,彌補相關標準的不足和檢測方法的缺陷,為企業、科研機構的科學研究和質量控制提供方法保障,給相關科研檢測機構和監管部門提供技術支持,具有廣闊的應用前景和顯著的社會經濟效益。