氮摻雜碳點(diǎn)的開關(guān)型熒光傳感器檢測蔬菜中的生物硫醇

何 諧,雒雪麗,李春花,韓 雍,陳秀梅,李忠宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

蔬菜中的生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、γ-谷氨酰半胱氨酸(GGC)和卡托普利(CAP)等小分子物質(zhì)在生理系統(tǒng)中起著重要的作用[1]。它們既可以作為抗氧化劑[2]保護(hù)細(xì)胞免受可能導(dǎo)致癌癥和阿爾茨海默病的氧化損傷[3],也可以作為解毒劑和金屬離子發(fā)生反應(yīng)。其中,半胱氨酸在側(cè)鏈上具有巰基,在酶促反應(yīng)中起到親核試劑的作用,還可以有效地預(yù)防和治療放射性傷害[4]。還原型谷胱甘肽在細(xì)胞的生長、信號傳導(dǎo)、基因調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞正常功能的氧化還原平衡上起著關(guān)鍵作用[5]。如果將蔬菜或水果暴露在以消毒為目的的輻照和臭氧處理中,其所含有的硫醇可能會發(fā)生氧化且導(dǎo)致有毒副產(chǎn)品的產(chǎn)生。因此檢測生物和環(huán)境樣品中的小分子生物硫醇引起科學(xué)家們極大的興趣[6]。

常見檢測生物硫醇的方法包括電化學(xué)法[7]、比色法[8]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9]、分光光度法[10]和高效液相色譜法[11]等。這些方法具有靈敏度高和檢測限低等優(yōu)點(diǎn),但是電化學(xué)法、比色法、分光光度法對樣品的需求量較大、檢測用時(shí)較長,HPLC具有操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、所需儀器昂貴等缺點(diǎn)。熒光檢測法作為一種既省時(shí)又綠色環(huán)保的測定方法,受到眾多分析測試人員的青睞。

近幾年來,熒光探針在生物硫醇檢測和應(yīng)用方面取得了有效進(jìn)展[12]。目前,檢測生物硫醇的熒光傳感器主要包括有機(jī)染料、分子熒光和傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)。其中,有機(jī)染料容易光漂白,而QDs往往含有重金屬元素,因此限制了它們的廣泛使用。碳點(diǎn)(CDs)不僅具有與傳統(tǒng)量子點(diǎn)類似的發(fā)光性能和納米尺寸特性,還具較毒性較低、制備成本低廉、熒光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[13],因此利用CDs作為信號源來開發(fā)光學(xué)納米傳感器成為研究熱點(diǎn)。目前,許多基于CDs的傳感平臺是猝滅型熒光傳感器[14]。熒光可以被分析物直接淬滅,根據(jù)CDs熒光強(qiáng)度的改變來檢測分析物。然而這種檢測模型易受環(huán)境刺激的影響導(dǎo)致方法的分析性能降低。而開關(guān)型熒光傳感器模型是根據(jù)加入分析物后恢復(fù)的熒光進(jìn)行檢測,可以減少外界刺激造成的假陽性,因而具有更好的靈敏度[15]。

盡管研究人員已設(shè)計(jì)合成了許多識別硫醇的熒光探針,但是對于檢測食品基質(zhì)中生物硫醇的熒光探針未見報(bào)道。因此,本文以檸檬酸和尿素為原材料制備氮摻雜碳點(diǎn)(N-CDs),利用Hg2+對CDs熒光有良好的猝滅作用[16],而巰基和汞離子的親和力更強(qiáng),故生物硫醇可以將Hg2+從CDs表面競爭下來,從而使得CDs熒光恢復(fù)?；谝陨显?本文開發(fā)了一種熒光傳感器選擇性地檢測蔬菜中的生物硫醇,對檢測體系的pH、Hg2+濃度和孵化時(shí)間(熒光淬滅和恢復(fù))進(jìn)行優(yōu)化,并對探針的抗干擾性能以及準(zhǔn)確度進(jìn)行初步評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一水合檸檬酸、六水合三氯化鐵、氯化鉀、氯化鋅、氯化鈉 廣東光華科技股份有限公司;HgCl2山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;尿素、氯化錳、氯化鎂、冰乙酸 成都市科龍化工試劑廠;抗壞血酸 廣東化工攝影工程技術(shù)研究開發(fā)中心;甘氨酸 北京Solabio科技有限公司;谷胱甘肽、苯丙氨酸、硫酸奎寧、賴氨酸、色氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋(截留分子量1 Da) 北京索萊寶公司;無水氯化鈣 廣東光華化學(xué)廠有限公司;三水合乙酸鈉 四川西隴化工有限公司;所有試劑均為分析純,未進(jìn)一步純化。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 北京儀諾科興科技發(fā)展有限公司;DGG-9030B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信儀器公司;Perkin-Elmer LS-55熒光分光光度計(jì) 美國鉑金埃爾默公司;JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM) 日本JEOL公司;FE20/EL20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器公司;KH-250E超聲清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司;Vetex70傅里葉變換近紅外光譜(FT-IR) 德國布魯克公司;CP-224C分析天平 奧豪斯儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 N-CDs的制備 N-CDs通過水熱法[17]并加以改進(jìn)合成。具體步驟如下:將4.2 g檸檬酸和3.6 g尿素溶解于40 mL蒸餾水中,250 W超聲10 min形成透明溶液,將該溶液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中,在200 ℃下保持4 h。待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫后,將所得溶液用0.22 μm的水系濾膜過濾后,避光儲存于25 ℃下。

1.2.2 N-CDs的表征

1.2.2.1 形貌表征 采用透射電鏡觀察N-CDs的形貌和微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 光學(xué)表征 采用熒光光譜法對制備得到的N-CDs進(jìn)行發(fā)光性能表征。采用紫外光譜掃描法在200～800 nm波長范圍內(nèi),對N-CDs的紫外吸收進(jìn)行表征。

1.2.2.3 表面基團(tuán) 利用FT-IR對N-CDs的表面基團(tuán)進(jìn)行表征。

1.2.2.4 量子產(chǎn)率的測定 以硫酸奎寧為參比物質(zhì),采用斜率比較法[18]計(jì)算N-CDs的量子產(chǎn)率。將硫酸奎寧溶于0.1 mol/L H2SO4中,其量子產(chǎn)率(QY)是54%。用紫外分光光度計(jì)測量所有溶液在360 nm處的吸光度值A(chǔ)(為了最小化重吸收保證測量準(zhǔn)確,吸光度值小于0.1)。用熒光光譜儀測量所有溶液在360 nm激發(fā)波長下的熒光光譜,并記錄所得熒光光譜在370～700 nm范圍內(nèi)的積分面積值,此值為積分熒光強(qiáng)度通過記錄同一物質(zhì)一系列濃度的積分熒光強(qiáng)度和吸光度值,以吸光度值為橫坐標(biāo),積分熒光強(qiáng)為縱坐標(biāo)在Oringin 8.0中作圖,為系列點(diǎn)添加截距為0的線性擬合直線,得到直線的斜率。N-CDs的QY按照公式(1)計(jì)算:

Qx=Qst(Gradx/Gradst)(ηx/ηst)2

式(1)

其中,Q為量子產(chǎn)率,Grad為所擬合直線的斜率,η為溶劑的折射率。下標(biāo)st為硫酸奎寧,x為N-CDs。在本體系中,由于硫酸奎寧溶解在稀硫酸中,N-CDs溶解在去離子水中,所以ηx/ηst≈1。

1.2.3 探針的制備與優(yōu)化 采用單因素實(shí)驗(yàn)探討檢測體系pH、Hg2+濃度、孵育時(shí)間等因素對熒光猝滅效率、熒光恢復(fù)效率和熒光強(qiáng)度的影響,在優(yōu)化條件下構(gòu)建生物硫醇檢測方法。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.1 pH設(shè)定 N-CDs濃度為1 mmol/L,醋酸鹽緩沖液pH為3.6、4.0、4.6、5.0、5.6,向N-CDs溶液中加入濃度為400 μmol/L的Hg2+以猝滅熒光,室溫反應(yīng)10 min后在選定的熒光測試條件下掃描熒光光譜。同時(shí),在相應(yīng)體系中加入1 mmol/L 生物硫醇標(biāo)準(zhǔn)液以恢復(fù)熒光,室溫反應(yīng)10 min后掃描熒光光譜。根據(jù)所得熒光光譜,對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。根據(jù)熒光猝滅效率(Effq,式2)和熒光恢復(fù)效率(Effr,式3)確定最佳pH。

Effq(%)=(F0-F)/F0

式(2)

Effr(%)=(Fr-F)/(F0-F)

式(3)

其中,F和F0表示在加入和不加入Hg2+的情況下N-CDs在432 nm處的熒光強(qiáng)度;Fr為加入生物硫醇到N-CDs/Hg2+傳感體系后N-CDs在432 nm處的恢復(fù)熒光強(qiáng)度。

1.2.3.2 Hg2+濃度設(shè)定 N-CDs濃度為1 mmol/L,pH為優(yōu)化值,向N-CDs溶液中滴加不同濃度的Hg2+儲備液(100、200、300、400、500 μmol/L),反應(yīng)10 min后評估Hg2+濃度對N-CDs的熒光猝滅作用。同時(shí),在相應(yīng)體系中加入1 mmol/L生物硫醇標(biāo)準(zhǔn)液以恢復(fù)熒光,室溫反應(yīng)10 min后掃描熒光光譜。根據(jù)所得熒光光譜,對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。確定最佳Hg2+濃度。

1.2.3.3 孵育時(shí)間設(shè)定 熒光猝滅模式下孵育時(shí)間的優(yōu)化:設(shè)定N-CDs濃度為1 mmol/L,pH和Hg2+濃度為優(yōu)化值,在相應(yīng)體系中加入Hg2+溶液,將熒光掃描模式切換成Time Drive(時(shí)間步長0.01 s,掃描時(shí)間30 min),得到加入Hg2+后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線確定最佳猝滅孵育時(shí)間。

熒光恢復(fù)模式下孵育時(shí)間的優(yōu)化:設(shè)定N-CDs濃度為1 mmol/L,pH和Hg2+濃度為優(yōu)化值,加入Hg2+溶液后室溫孵育10 min。在相應(yīng)體系中加入1 mmol/L生物硫醇標(biāo)準(zhǔn)液,在Time Drive熒光掃描模式下得到加入生物硫醇后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線確定最佳孵育時(shí)間。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在優(yōu)化條件下,將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的氯化汞溶液依次加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優(yōu)化值,0.01 mol/L),并在室溫下孵育10 min后加入不同濃度的生物硫醇標(biāo)準(zhǔn)液(0、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600 μmol/L),室溫振蕩孵育10 min后,掃描熒光光譜。數(shù)據(jù)擬合得到熒光恢復(fù)因子F/F0(F0和F是分別在不存在和存在生物硫醇的情況下N-CDs/Hg2+傳感體系在432 nm處的熒光強(qiáng)度)隨濃度C變化曲線及決定系數(shù)R2、線性范圍及LOD(式4)。

LOD=3δ/k

式(4)

式中:δ為空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3);k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.5 干擾實(shí)驗(yàn) 傳感器的選擇性對于實(shí)際蔬菜樣品中生物硫醇的檢測至關(guān)重要,實(shí)際蔬菜含有礦物離子、有機(jī)酸和氨基酸。因此,采用可能共存的干擾物質(zhì)(苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+和K+)來評價(jià)該方法的選擇性。分別將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+、K+和Hg2+溶液加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優(yōu)化值,0.01 mol/L),并在室溫下孵育10 min后用熒光強(qiáng)度響應(yīng)[(F/F0)-1]評估干擾物對N-CDs的熒光猝滅作用。另外,將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的Hg2+溶液加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優(yōu)化值,0.01 mol/L),室溫下孵育10 min后再分別加入1 mmol/L的苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、GSH和Cys,室溫下孵育10 min后用熒光強(qiáng)度響應(yīng)[(F/F0)-1]評估干擾物對N-CDs/Hg2+的熒光恢復(fù)作用。

1.2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn) 依據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法處理荷蘭豆和螺絲辣椒:荷蘭豆和螺絲辣椒各取三個(gè)樣品進(jìn)行分析,將荷蘭豆去皮洗凈與螺絲辣椒洗凈的果肉切塊混合,分別從荷蘭豆和螺絲辣椒的切片中取4.5 g置于醋酸鹽緩沖液(分別放置于pH=5.0和pH=5.6)中,共4個(gè)分析樣品,將樣品用研缽研碎(研磨時(shí)間為15～20 min),并以10000×g離心15 min,然后取出1 mL上清液,用構(gòu)建的探針檢測處理后的分析物溶液。每個(gè)樣品重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2010版Excel和Nanomeasure軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Origin 8.0軟件繪制圖。使用Minitab 16.2.3軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均表示為平均值,通過單因素方差分析評估所有數(shù)據(jù)的差異,當(dāng)方差分析中的p值表明統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),通過Tukey檢驗(yàn)評估差異,p<0.05的值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。本文所有實(shí)驗(yàn)均做三次平行(除優(yōu)化孵育時(shí)間外)。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-CDs的表征結(jié)果

從N-CDs的TEM圖(圖1)可以看出,所制備的N-CDs為準(zhǔn)球形。

圖1 N-CDs的TEM圖

通過使用Nanomeasure軟件對大約100個(gè)N-CDs納米顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,從圖2可知N-CDs的粒徑分布范圍為0.88～7.94 nm,平均直徑為4.53 nm。

圖2 N-CDs的粒徑分布圖

N-CDs的紫外吸收光譜和熒光光譜如圖3所示,331 nm處的紫外吸收峰屬于N-CDs表面C=O或C-OH的n-π*躍遷引起的。熒光光譜表明,N-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射峰分別是340和432 nm。該N-CDs的Stokes’位移為92 nm,這一較大的Stokes’位移可以有效避免激發(fā)和發(fā)射光譜之間的重疊而有利于后期的分析檢測應(yīng)用。從圖3的插圖可以看出,所制備的N-CDs在水中分散性良好,在365 nm的紫外燈管照射下發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)光。

圖3 N-CDs的紫外吸收光譜(1)、激發(fā)光譜(2)和發(fā)射光譜(3)

從N-CDs的紅外光譜(圖4)可以看出波數(shù)在3229、3360和3444 cm-1的峰屬于-OH的伸縮振動,寬的羥基吸收帶表明N-CDs表面上存在多個(gè)羥基結(jié)構(gòu),賦予CDs更高的極性和親水性[19]。2985、2980和3040 cm-1的峰屬于C-H的伸縮振動,1580、1490和1400 cm-1處的吸收峰表明N-CDs表面存在C=O/N-H、-COOH,1054 cm-1處的吸收峰屬于C-O。FTIR結(jié)果顯示-OH的伸縮振動發(fā)生移動,可能是Hg2+和N-CDs的-OH發(fā)生了絡(luò)合作用導(dǎo)致N-CDs的熒光猝滅。

如圖5所示,激發(fā)波長為340 nm,以硫酸奎寧為參比,N-CDs的QY為32.72%。摻雜后CDs的QY明顯高于僅僅以檸檬酸為唯一碳源制備的CDs的QY。以上表征說明合成的N-CDs具有較高的極性、親水性、量子產(chǎn)率以及較大的Stokes’位移，有利于檢測蔬菜中的生物硫醇。

圖5 N-CDs的量子產(chǎn)率

2.2 生物硫醇檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 體系pH 生物硫醇在中性和堿性條件下穩(wěn)定性差,其中半胱氨酸易被氧化為胱氨酸,谷胱甘肽易被氧化為氧化型谷胱甘肽,降低pH可使其穩(wěn)定性增強(qiáng),由于pH對生物硫醇和Hg2+有影響,因此需要對探針檢測生物硫醇的pH進(jìn)行優(yōu)化。相應(yīng)的曲線如圖6所示?？梢詮膱D6看出在pH從3.6增加到4.0和從4.6增加到5.0時(shí),熒光淬滅效率(Effq,見式2)以較低的速度增強(qiáng),當(dāng)pH從4.0增加到4.6時(shí),Effq又快速增加。最后,Effq在pH5.0～5.6內(nèi)無顯著變化(p>0.05)。在pH3.6～4.6的范圍內(nèi),羧酸酯基團(tuán)和胺基團(tuán)被質(zhì)子化,導(dǎo)致N-CDs帶負(fù)電。N-CDs表面羧基的質(zhì)子化作用隨著pH的增加而逐漸被去質(zhì)子化過程所取代,導(dǎo)致帶負(fù)電荷的羧基可吸引帶相反電荷的Hg2+。N-CDs表面的-NH3+在pH從4.6增加到5.0的過程中趨于逐漸去質(zhì)子化,從而增強(qiáng)了N-CDs之間的靜電斥力,并增加了熒光強(qiáng)度。在pH5.0～5.6的范圍內(nèi),N-CDs的熒光強(qiáng)度無顯著變化(p>0.05),可能是由于-NH3+和-COOH去質(zhì)子平衡。

圖6 N-CDs-Hg2+,N-CDs-Hg2++Cys/GSH在不同pH下對Effq和Effr的響應(yīng)

當(dāng)pH從3.6增加到4.0和從4.0增加到4.6時(shí),GSH的熒光恢復(fù)效率(Effr,見式3)分別以較高的速度增強(qiáng)和降低,當(dāng)pH從4.6增加到5.0和從5.0增加到5.6時(shí),N-CDs-Hg2++GSH的Effr分別以較低的速度增強(qiáng)和降低。在pH為4.0、4.6和5.0時(shí)有較大的GSH的Effr,分別為104.1%、85.80%和84.80%。綜合考慮N-CDs-Hg2+的Effq和N-CDs-Hg2++GSH的Effr,因此選擇pH=5.0用于構(gòu)建檢測GSH的探針。同檢測GSH,選擇pH=5.6用于構(gòu)建檢測Cys的探針。

2.2.2 Hg2+終濃度 探討了Hg2+的濃度對熒光猝滅和恢復(fù)的影響,相應(yīng)的曲線如圖7A和圖7B所示?？梢詮膱D7A看出,在pH=5.0的條件下,檢測GSH的Effq在測試的Hg2+濃度范圍內(nèi)逐漸升高,升高的速度逐漸降低,這表明Hg2+鍵合到N-CDs上的量逐漸增加接近飽和。在Hg2+濃度為200 μmol/L時(shí),有最大檢測GSH的Effr為88.20%。在N-CDs/Hg2+傳感系統(tǒng)中,Hg2+濃度對于提高分析性能至關(guān)重要,當(dāng)Hg2+濃度較低時(shí),Effr對GSH測定的背景熒光值比較高,同時(shí)線性范圍窄;高濃度的Hg2+又使得低濃度GSH恢復(fù)熒光的能力有限,直接影響到測定的靈敏性。綜合考慮探針檢測的靈敏度和線性范圍及實(shí)驗(yàn)安全性,因此選擇200 μmol/L Hg2+用于構(gòu)建檢測GSH的探針。

另外,從圖7B可以看出,在pH=5.6的條件下,檢測Cys的Effq在測試的Hg2+濃度范圍內(nèi)逐漸升高,升高的速度逐漸降低,這同樣說明Hg2+鍵合到N-CDs上的量逐漸增加接近飽和。當(dāng)Hg2+的濃度低于200 μmol/L時(shí),檢測Cys的Effr隨著Hg2+濃度的增加逐漸變小,當(dāng)Hg2+的濃度在200～400 μmol/L時(shí),檢測Cys的Effr隨著Hg2+濃度的增加逐漸增加,在Hg2+的濃度為300～400 μmol/L時(shí),檢測Cys的Effr增加速度最低,當(dāng)Hg2+濃度為400 μmol/L時(shí)有最大Effr為87.66%。當(dāng)Hg2+的濃度繼續(xù)增加時(shí),檢測Cys的Effr在400～500 μmol/L范圍內(nèi)逐漸降低。同檢測GSH,綜合考慮探針檢測的靈敏度和線性范圍及實(shí)驗(yàn)安全性,因此選擇300 μmol/L Hg2+用于構(gòu)建檢測Cys的探針。

圖7 (A)Hg2+終濃度對檢測GSH的Effq和Effr的響應(yīng);(B)Hg2+終濃度對檢測Cys的Effq和Effr的響應(yīng)

2.2.3 孵育時(shí)間 研究孵育時(shí)間(猝滅和恢復(fù)時(shí)間)以評估熒光傳感器對生物硫醇的響應(yīng)時(shí)間,圖8A為在pH=5.0條件下N-CDs的熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間(熒光猝滅/GSH恢復(fù))變化的曲線。圖8B為在pH=5.6條件下N-CDs的熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間(熒光猝滅/cys恢復(fù))變化的曲線。從圖8A可以看出,N-CDs熒光強(qiáng)度在加入200 μmol/L Hg2+后在0～460 s時(shí)呈下降趨勢,隨著時(shí)間的增加,N-CDs熒光強(qiáng)度在460 s后達(dá)到平衡(p>0.05),這意味著N-CDs表面的官能團(tuán)(例如-NH2、-OH和-COOH)可以快速與Hg2+相互作用而引起熒光猝滅并在460 s后達(dá)到飽和。向N-CDs/Hg2+體系中加入1 mmol/L GSH后,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過380 s后,熒光強(qiáng)度基本保持不變(p>0.05),表明380 s足以使GSH恢復(fù)N-CDs的熒光。因此,當(dāng)檢測GSH時(shí),猝滅孵育時(shí)間為460 s,恢復(fù)的孵育時(shí)間為380 s。同檢測GSH,當(dāng)檢測Cys時(shí),猝滅孵育時(shí)間為440 s,恢復(fù)的孵育時(shí)間為400 s。因?yàn)閮x器的噪音的影響,圖中存在幾個(gè)N-CDs熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增加的時(shí)間段。

圖8 (A)N-CDs的熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間(熒光猝滅/GSH恢復(fù))的變化;(B)N-CDs的熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間(熒光猝滅/Cys恢復(fù))的變化

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)條件下,利用設(shè)計(jì)的可切換熒光“開-關(guān)-開”傳感器對生物硫醇進(jìn)行檢測,N-CDs/Hg2+的熒光強(qiáng)度隨著生物硫醇濃度的增加逐漸恢復(fù)。熒光恢復(fù)因子F/F0(F0和F是分別在不存在和存在生物硫醇的情況下N-CDs/Hg2+傳感體系在432 nm處的熒光強(qiáng)度)同GSH濃度的曲線如圖9所示。GSH濃度在0～300 μmol/L范圍內(nèi),F/F0與GSH濃度之間具有良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)為0.9948。線性方程表示為F/F0=0.00324[C]+0.9686,其中[C]是GSH的濃度,LOD為2.56 μmol/L。熒光恢復(fù)因子F/F0同Cys濃度的曲線如圖10所示。Cys濃度在100～400 μmol/L范圍內(nèi),F/F0與Cys濃度之間也具有良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)為0.99207。線性方程表示為F/F0=0.00408C+0.61037,其中C是Cys的濃度,檢測限(LOD)為3.46 μmol/L。

圖9 不同GSH濃度下N-CDs/Hg2+傳感探針的熒光發(fā)射光譜圖

圖10 不同GSH濃度下N-CDs/Hg2+傳感探針的熒光發(fā)射光譜圖

2.4 干擾試驗(yàn)

本文所開發(fā)的熒光傳感器的選擇性對于實(shí)際蔬菜樣品中生物硫醇含量的測定具有重要影響。由于實(shí)際蔬菜樣品中含有礦物離子,有機(jī)酸和氨基酸等，因此,采用可能共存的干擾(苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+和K+)來評價(jià)該方法的選擇性,并且熒光強(qiáng)度響應(yīng)[(F/F0)-1]與干擾物種類關(guān)系的柱形圖如圖11所示。從圖11(A)可以看出,Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+和K+對N-CDs熒光強(qiáng)度的影響可忽略不計(jì)(熒光相應(yīng)<5%),而Fe3+對N-CDs的熒光強(qiáng)度的影響較弱,只有Hg2+能夠較大程度地猝滅N-CDs的熒光強(qiáng)度,表明N-CDs對Hg2+具有高選擇性。從圖11(B)可以看出,苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸和抗壞血酸對N-CDs/Hg2+熒光檢測生物硫醇的影響可忽略不計(jì)(熒光相應(yīng)<5%),結(jié)果表明,構(gòu)建的傳感器在存在干擾物時(shí)可用于蔬菜中生物硫醇的檢測。

圖11 N-CDs對Hg2+和干擾離子以及N-CDs/Hg2+對GSH和Cys以及干擾物的熒光強(qiáng)度響應(yīng)

2.5 加標(biāo)回收

將此傳感器用于荷蘭豆和螺絲辣椒中GSH和Cys的檢測。GSH和Cys分別做三種不同濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn),所有試驗(yàn)做三次平行,結(jié)果如表1所示,樣品加標(biāo)回收率都在80%～120%之間,證明此方法的準(zhǔn)確度較好。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建的N-CDs/Hg2+探針具有較好的穩(wěn)定性,基于這種探針設(shè)計(jì)了特異性檢測生物硫醇的方法。以檢測體系pH、Hg2+濃度、孵育時(shí)間(熒光猝滅和恢復(fù)時(shí)間)為單因素,優(yōu)化得到GSH的最佳檢測條件為pH=5.0,Hg2+濃度為200 μmol/L,460 s熒光猝滅和380 s熒光恢復(fù),最佳檢測Cys條件為pH為5.6,Hg2+濃度為300 μmol/L,440 s熒光猝滅和400 s熒光恢復(fù),在最優(yōu)條件下該傳感器對0～300 μmol/L的GSH和100～400 μmol/L的Cys具有線性響應(yīng),檢測限分別為2.56、3.46 μmol/L。該方法的空白加標(biāo)回收率為80%～120%之間。干擾實(shí)驗(yàn)表明蔬菜中可能存在的干擾物對傳感器沒有顯著影響,因此該傳感器用于檢測蔬菜中的生物硫醇具有可接受的選擇性。另外,該傳感器具有快速的熒光猝滅和恢復(fù)響應(yīng)、較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,為食品基質(zhì)中生物硫醇的熒光快速檢測提供一種新思路。