牛樟芝醇提物體外抗炎活性研究

李木霞,蘇冀彥,李 丹,林 吉,謝意珍2,,李運(yùn)容

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510006;2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司,廣東廣州 510530;3.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510070;4.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西南寧 530021)

牛樟芝(Antrodiacinnamomea,AC)又稱樟芝、牛樟菇、樟菰、樟內(nèi)菇、紅樟等,是一種獨(dú)特而珍貴的臺灣地道藥食兩用真菌,屬于真菌界(Kingdom Fungi)擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的多年生蕈菌類[1-3]。野生牛樟芝生長于臺灣獨(dú)有的珍貴樹種牛樟樹的心材內(nèi)壁或枯死伏地的牛樟樹表面,有“森林中的紅寶石”之稱。牛樟芝醇提物(Antrodiacinnamomeaethanol extract,AC-E)主含萜類,多為三萜,且野生牛樟芝中萜類的含量比培養(yǎng)的牛樟芝中高出10～30倍[4]。現(xiàn)有研究表明,其三萜類化合物具有抗腫瘤[5-6]、抗病毒[7-8]、抗炎[9-10]和保肝[11-12]等藥理作用,可預(yù)防和治療癌癥、肝炎等多種疾病。本實(shí)驗(yàn)建立體外炎癥模型,旨在研究牛樟芝抗炎活性的主要機(jī)制,為牛樟芝在新藥的應(yīng)用開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

脾是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官,內(nèi)含大量的免疫細(xì)胞,在體液免疫和細(xì)胞免疫的地位極其重要。研究中藥及其有效成分對機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用是研究中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用的一個重要方面[13],淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是非常重要的免疫指標(biāo),其中T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)是反映T細(xì)胞功能和機(jī)體細(xì)胞免疫的主要指標(biāo)之一[14]。外源性化學(xué)物(如藥物和環(huán)境污染物等)對T淋巴細(xì)胞分化、成熟、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響一直是免疫毒理學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。T淋巴細(xì)胞(CD3+)接受抗原刺激可分化成不同亞型,其中包括T細(xì)胞亞群輔助性T細(xì)胞(Helper T cell、Th、CD3+CD4+)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T cell,Tc,CD3+CD8+),機(jī)體維持正常免疫功能有賴于各種免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞亞群之間的相互協(xié)作和制約,進(jìn)而產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答,使之既可以清除異物抗原,又可以不損傷正常組織。刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA)是從巴西橡膠刀豆(Canavaliabrasiliensis)中提取的植物凝集素,是一種多克隆非特異性T細(xì)胞的有絲分裂原,是T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)常用的刺激劑。

動物預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AC-E有明顯的抗炎作用,但作用機(jī)制尚未明確。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn),從牛樟芝中分離的馬來酰亞胺衍生物、糖蛋白可以有效降低脂多糖引起的RAW264.7 巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答,顯示牛樟芝具有抗炎作用。研究表明[18],牛樟芝菌絲體中的methyl antcinate K 可以增強(qiáng)樹突細(xì)胞活性，促進(jìn)Th2 細(xì)胞分化,增強(qiáng)免疫應(yīng)答,具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。Th細(xì)胞通過合成和分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞的增殖與分化,協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用;Tc細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,能特異性殺死異常靶細(xì)胞。正常情況下,T淋巴細(xì)胞群中的Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞的比值維持動態(tài)平衡,它們相互協(xié)作或相互制約,以產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答,如果其平衡被破壞,發(fā)生免疫紊亂,就會產(chǎn)生一系列病理改變及疾病[19]。本實(shí)驗(yàn)采用ConA刺激脾淋巴細(xì)胞增殖模擬機(jī)體炎癥狀態(tài),觀察牛樟芝提取物對上述體外模型中T細(xì)胞的影響,以探討牛樟芝潛在的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雄性BALB/c小鼠(SCXK(粵)2013-0002,SPF級,體重18～22 g) 購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)于廣東省微生物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心(室溫20～24 ℃,相對濕度40%～70%,自由飲水?dāng)z食);牛樟芝(采摘后迅速低溫干燥,避光保存) 臺灣;RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗(10000 units/mL青霉素,10000 μg/mL鏈霉素) Corning公司(美國);胰酶細(xì)胞消化液 Hyclone公司(美國);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS) 依科賽生物(中國);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS) Gibco公司(美國);牛血清白蛋白(Albumin BovineⅤ,BSA) Solarbio公司(美國);MTS粉末(Cell Titer 96? AQueous MTS Reagent Powder) Promega公司(美國);刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA) Sigma公司(美國);Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(80090352) 聯(lián)科生物(中國);二甲基亞砜(DMSO,AR) 天津市富宇精細(xì)化工有限公司(中國);流式細(xì)胞檢測抗體FITC anti-mouse CD3(4320569)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(4280800)、APC-CyTM7 anti-mouse CD8(7025872) eBioscience公司(美國);TNF-αELISA試劑盒(AD20180710)、IFN-γELISA試劑盒(AD20180710) Andy gene 公司(美國)。

BSC-1800IIA2型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司(中國);Gabaxy 170S+型CO2培養(yǎng)箱 Eppendorf公司(德國);Thermo MK3型酶標(biāo)儀 Thermo公司(美國);IX71型顯微鏡 Olympus公司(日本);IC1000型自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 Countstar公司(中國);AUY220型電子天平 島津公司(日本);RE6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(中國);FACSCanToⅡ流式細(xì)胞分析儀 Becton Dickinson公司(美國);DFY-500型500 g搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 浙江大德藥業(yè)集團(tuán)有限公司(中國);GB6003-85型藥典檢驗(yàn)篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司(中國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 牛樟芝醇提物(AC-E)的制備 將牛樟芝子實(shí)體經(jīng)除雜、清洗、晾曬至干后,置于烘箱,60 ℃干燥4 h至水分含量8%以下[20]。取烘干后的子實(shí)體經(jīng)搖擺式高速中藥粉碎機(jī)中打粉(25000 r/min,每5 s間隔一次,粉碎3次),使用孔徑為4目(65 μm)～50目(355 μm)藥典檢驗(yàn)篩進(jìn)行篩選,收集子實(shí)體顆粒[21]。稱取上述顆粒20 g,裝入圓底燒瓶,加入86%乙醇200 mL,室溫浸泡4 h后,再加入86%乙醇600 mL,80 ℃加熱回流1.5 h,過濾,收集濾液,濾渣重復(fù)上述加熱回流提取操作1次[21],將所得2次濾液合并,減壓濃縮至無醇味,凍干即得。

1.2.1.2 RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制 10%滅活FBS+1%青鏈霉素雙抗+89% RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基

1.2.1.3 AC-E配制 稱取100 mg AC-E,加DMSO使AC-E的濃度為100 mg/ml,溶解完全后用0.22 μm微孔濾膜濾過;濾液分別用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制成孔內(nèi)終濃度為50、25、12.5 μg/mL三個濃度。

1.2.1.4 ConA溶液配制 用RPMI-1640完全培養(yǎng)基將ConA配制成孔內(nèi)終濃度為3 μg/mL。

1.2.1.5 紅細(xì)胞裂解液配制 精確稱取氯化銨(9290 mg)、碳酸氫鉀(1000 mg)、EDTA(37 mg),溶于1 L雙蒸水中,調(diào)節(jié)pH為7.21～7.23,過0.22 μm微孔濾膜。

1.2.2 脾細(xì)胞制備 小鼠脫臼處死[17],浸泡在75%乙醇中消毒,轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi),剖取脾臟,用PBS清洗。另在超凈臺內(nèi)準(zhǔn)備好6 cm培養(yǎng)皿,倒入少量PBS,覆蓋一張200目滅菌濾布,將脾臟置于濾布上,稍微剪碎后,用玻璃注射器活塞研磨脾臟至無明顯塊狀。移除濾布,轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿濾液至離心管,離心(300×g,5 min)去上清;加入1 mL自制ACK裂解液(室溫)重懸細(xì)胞,室溫靜置5 min,加入7 mL預(yù)冷PBS,離心(300×g,5 min),去上清;再分別用5 mL預(yù)冷PBS離心洗滌2次后,用400 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×106個/mL。

1.2.3 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響 取兩塊96孔板,命名為板1、板2,其中板1設(shè)正常組、AC-E組(50、25、12.5 μg/mL);板2設(shè)正常組、模型組、AC-E組(50、25、12.5 μg/mL)。

板1給藥如下:

正常組:完全培養(yǎng)基+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細(xì)胞懸液;

AC-E組:不同濃度AC-E+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細(xì)胞懸液。

板2給藥如下:

正常組:RPMI-1640完全培養(yǎng)基+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細(xì)胞懸液;

模型組:ConA溶液+含0.1% DMSO RPMI-1640完全培養(yǎng)基+細(xì)胞懸液;

AC-E組:ConA溶液+不同濃度AC-E+細(xì)胞懸液。

每組設(shè)3個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h在每孔加入MTS液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測光密度 OD值,作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo),調(diào)零孔僅加200 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基。相對細(xì)胞活力計(jì)算公式如下。

相對細(xì)胞活力(%)=(OD藥物組-OD調(diào)零孔/OD正常組-OD調(diào)零孔)×100

1.2.4 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響 分組及給藥與1.2.3板2一致,每組設(shè)3個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細(xì)胞吹打均勻,收集細(xì)胞懸液,使用FCM檢測AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響。分為單陽性對照管和實(shí)驗(yàn)管,分別加入2 mL預(yù)冷PBS離心(300×g,5 min)洗滌兩次,棄上清。

單陽性對照管加入500 μL Apoptosis Positive Control Solution重懸,置冰上孵育30 min,用預(yù)冷PBS離心(300×g,5 min),洗滌棄上清,加入適量預(yù)冷1×Binding Buffer重懸,并加入數(shù)量相同且未經(jīng)處理的活細(xì)胞與之混合,加預(yù)冷1×Binding Buffer補(bǔ)充至1.5 mL,等分成三管,其中一管為空白對照管、兩管為單陽性對照管。單陽性對照管分別加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI,室溫避光孵育5 min,即可上機(jī)調(diào)試。

實(shí)驗(yàn)管分別加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min,即可上機(jī)檢測。

細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡早期細(xì)胞比例(%)+凋亡晚期細(xì)胞比例(%)

1.2.5 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞比例及T細(xì)胞亞群的影響 分組及給藥與1.2.3板2一致,每組設(shè)3個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細(xì)胞吹打均勻,收集細(xì)胞懸液,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測AC-E對脾淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞、Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞的比例及活化程度。

單陽性對照和空白對照:取5管,分別加入FITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test),APC-CyTM7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test)的0.5% BSA/PBS緩沖液,作為單陽性對照;同時設(shè)一個無抗體空白對照,作為陰性對照,輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育30 min。加入600 μL 0.5% BSA/PBS緩沖液洗滌2次。最后用0.5% BSA/PBS緩沖液200 μL重懸細(xì)胞,即可上機(jī)調(diào)試。

樣品:各樣品管,每管加入60 μL含F(xiàn)ITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test)、APC-CyTM7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test)的0.5% BSA/PBS緩沖液;輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育30 min,加入600 μL 0.5% BSA/PBS緩沖液洗滌2次,最后用0.5% BSA/PBS緩沖液200 μL重懸細(xì)胞,即可上機(jī)檢測。

1.2.6 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ表達(dá)的影響 分組及給藥與1.4板2一致,每組設(shè)3個復(fù)孔,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后,在96孔板中將細(xì)胞吹打均勻,收集細(xì)胞懸液,3000 r/min離心(20 min),收集細(xì)胞上清液,操作步驟按照ELISA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞活力的影響

由圖1A可知,AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用,圖1B中,模型組細(xì)胞增殖相對細(xì)胞活力(177.40%±8.686%)與正常組相比差異極顯著(p<0.01);AC-E干預(yù)72 h后,低劑量組的相對細(xì)胞活力(173.80%±4.075%)與模型組相比無顯著變化;中高劑量則極顯著低于模型組(128.90%±8.499%、82.49%±3.528%),說明AC-E對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖有極顯著的抑制作用(p<0.01),AC-E對該炎癥模型同樣具有抗炎作用。

圖1 AC-E對小鼠脾淋巴相對細(xì)胞活力的影響

2.2 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響

圖2A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組對脾淋巴細(xì)胞凋亡影響的代表性圖譜,圖2B是給予ConA及AC-E干預(yù),小鼠脾淋巴細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后的凋亡率。

圖2 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響

由圖2A得,正常組的細(xì)胞幾乎無凋亡現(xiàn)象,而模型組及三個給藥組的細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的凋亡。由圖2B可知,小鼠脾淋巴細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后,未經(jīng)ConA刺激的正常組凋亡不明顯(1.100%±0.100%),加入ConA刺激的模型組(4.533%±0.208%)出現(xiàn)極顯著凋亡(p<0.01),加入ConA刺激后給予AC-E干預(yù),低中高劑量組(6.067%±1.041%、8.800%±0.265%、12.500%±1.249%)的細(xì)胞凋亡率極顯著升高(p<0.01)。且較于模型組,中高濃度給藥組的細(xì)胞極顯著凋亡(p<0.01)。而ConA特異性刺激T淋巴細(xì)胞增殖,給予AC-E干預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡,因此可以推測AC-E是否誘導(dǎo)了T細(xì)胞凋亡。

2.3 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞比例的影響

圖3A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組(低、中、高劑量)T細(xì)胞比例的代表性圖譜,圖3B是給予ConA及AC-E干預(yù),小鼠脾淋巴細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后T細(xì)胞的比例變化。

圖3 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞比例的影響

由圖3A得,模型組的T細(xì)胞比正常組明顯增加,給藥組的T細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的減少。T細(xì)胞在許多免疫性疾病的發(fā)病中起重要作用[22-24],它所啟動的免疫可有效保護(hù)機(jī)體免受感染的侵害或者抑制腫瘤發(fā)生[21,25]。然而,若被激活及過度增殖的T細(xì)胞所啟動的免疫反應(yīng)不受控制,或者原有的免疫平衡被打破,則可誘發(fā)多種嚴(yán)重的免疫性疾病。由圖3B可知,ConA刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞雖有增殖(模型組78.170%±1.139%),但給予AC-E干預(yù)后,與正常組(70.530%±2.554%)相比,低劑量組(70.100%±1.419%)的T細(xì)胞比例無顯著差異,中、高劑量組(60.630%±2.803%、51.670%±2.074%)的T細(xì)胞比例分別顯著(p<0.05)、極顯著(p<0.01)降低,說明低劑量的AC-E使受ConA刺激增殖的T細(xì)胞控制在正常免疫水平。

2.4 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群的影響

圖4A是FCM檢測正常組、模型組、給藥組(低、中、高劑量)的T 細(xì)胞亞群比例的代表性圖譜,圖4B是給予ConA及AC-E干預(yù),小鼠脾淋巴細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后T細(xì)胞亞群的比例變化。

圖4 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群的影響

如圖4A造模及給藥后,Th細(xì)胞減少,而Tc細(xì)胞明顯增多。圖4B中,小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激給藥后,低、中、高劑量組(40.410%±1.542%、34.090%±1.799%、33.370%±1.694%)的Th細(xì)胞比例極顯著低于正常組(62.980%±2.534%,p<0.01),模型組(51.440%±2.059%)亦有極顯著降低(p<0.01),但圖4C中模型組(21.390%±0.551%)極顯著高于正常組(6.205%±0.872%，p<0.01),圖4D中模型組(2.412%±0.154%)Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞的比例仍然極顯著少于正常組(10.640%±1.793%,p<0.01),說明ConA刺激T細(xì)胞增殖后更多地轉(zhuǎn)化為Tc細(xì)胞。而對于Tc細(xì)胞來說,低、中、高劑量組(23.740%±0.357%、20.110%±0.480%、13.010%±0.150%)均極顯著高于正常組(6.205±0.872%,p<0.01),低劑量組的Tc細(xì)胞比例極顯著高于模型組(p<0.01),可能是因?yàn)榈蛣┝康腁C-E作為外源物質(zhì)對脾淋巴細(xì)胞也有刺激作用,激活T細(xì)胞向Tc細(xì)胞轉(zhuǎn)化,見圖4C。由圖4D中可知,各組Th/Tc細(xì)胞的比例均極顯著低于正常組(p<0.01),結(jié)合圖3,說明T細(xì)胞在ConA刺激及給予AC-E干預(yù),T細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡是由于體系內(nèi)Th/Tc需維持動態(tài)平衡而出現(xiàn)的Th細(xì)胞及Tc細(xì)胞凋亡所致。

2.5 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ表達(dá)的影響

圖5A是小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α的表達(dá),圖5B是AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ表達(dá)的影響。

圖5 AC-E對小鼠脾淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ分泌的影響

牛樟芝的抗炎作用與降低人外周血單核細(xì)胞中TNF-α、IL-6 及中介物NO、PGE2 水平,抑制巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-18 分泌及NLRP3 炎性體,激活MAPK、NF-κB信號通路有關(guān)[26-27]。模型組(24.860±2.007 ng/L)的TNF-α濃度與正常組(9.084±0.915 ng/L)相比,極顯著升高(p<0.01),低、中、高劑量組(17.490±0.638、13.240±1.472、8.196±0.289 ng/L)的TNF-α濃度相比于模型組極顯著下降(p<0.01),見圖5A。模型組(55.550±0.089 ng/L)的IFN-γ濃度極顯著高于正常組(45.880±0.957 ng/L,p<0.01),高劑量組(46.580±0.957 ng/L)的IFN-γ濃度與正常組無顯著性差異,相對于模型組顯著下降(p<0.05),見圖5B。說明AC-E的抗炎作用可通過抑制脾淋巴細(xì)胞分泌的TNF-α及IFN-γ發(fā)揮作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用ConA刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的體外炎癥模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ConA刺激及給予AC-E干預(yù)后,AC-E組的小鼠脾淋巴細(xì)胞的相對活力及分泌的TNF-α、IFN-γ與正常組相近,說明AC-E對該模型具有抗炎作用,具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。