一株自然發(fā)酵甘薯酸漿的促淀粉絮凝酵母菌的分離鑒定及其共凝集特性

季子非,王筱瑜,田 原,許云賀,郭浩男,邢 鋮,王淋楓,張莉力

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

酸漿法沉降淀粉在我國已有很長的歷史,酸漿是用加水磨漿的綠豆或甘薯制成后經(jīng)產(chǎn)酸類微生物自然發(fā)酵而形成的淡黃色有酸味液體[1]。在傳統(tǒng)淀粉的生產(chǎn)過程中,加入酸漿會使淀粉乳中的淀粉顆粒立即凝聚,重力變大，淀粉迅速沉降,此時使用的酸漿就是一種絮凝淀粉的微生物絮凝劑。雖然傳統(tǒng)酸漿法制淀粉不如現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)效率高,但此法所得的粉條等制品口感更佳,故酸漿法在實際生產(chǎn)中依然有著廣泛應(yīng)用[2-4]。張莉力等[5-6]研究發(fā)現(xiàn),在乳酸菌的表層存在一類特殊功能性蛋白,可以特定識別和結(jié)合淀粉顆粒,并且可以把大分子量蛋白質(zhì)分解為短鏈的肽類,使得蛋白質(zhì)和淀粉的比重差增大,從而使淀粉加速下沉,蛋白類物質(zhì)在上層清液中被分離。吳衍庸等[7]的研究中發(fā)現(xiàn),酸漿中酸含量、pH及金屬離子等因素也會影響淀粉沉降效率。有些酵母菌能和乳酸菌共生,Freitas等[8]研究表明,當(dāng)具有發(fā)酵乳糖性質(zhì)的酵母菌與乳酸菌共生培養(yǎng)時,乳酸菌產(chǎn)酸性能會大幅增加,這可能是因為多種微生物在生長過程中的代謝產(chǎn)物可以被相互利用,其機制有待進一步研究。

微生物的共凝集現(xiàn)象在自然界中普遍存在,但目前這方面的研究主要集中在細(xì)菌與細(xì)菌間的共凝集,關(guān)于乳酸菌與酵母菌共凝集的研究較少。實驗前期已從自然發(fā)酵酸漿中分離出兩株對淀粉具有高絮凝活性的乳酸菌[9-10],乳酸菌的純培養(yǎng)液對淀粉具有較高的絮凝活性,但與自然發(fā)酵酸漿的絮凝活力相比仍有差距。在后期的研究中發(fā)現(xiàn),酸漿中的一些酵母菌雖然不具有絮凝淀粉的活性,但將這些酵母菌接入乳酸菌發(fā)酵液后,可以明顯提高乳酸菌發(fā)酵液對淀粉的絮凝活性,并發(fā)現(xiàn)在淀粉沉降顆粒中乳酸菌和酵母菌存在普遍的共凝集現(xiàn)象。所以,本實驗從自然發(fā)酵的甘薯酸漿中分離了與副干酪乳桿菌共凝集作用較強的酵母菌,并探究了幾種影響二者共凝集的理化因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級甘薯、馬鈴薯 錦州新瑪特超市;副干酪乳桿菌L1 錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物實驗室保存;MRS肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯霉素 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;DNA提取試劑盒(D2300) 北京索萊寶科技有限公司;PCR回收試劑盒(AP-GX-250) 愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司。

FA2104N型分析天平 蘭州中西儀器;BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JB-VS-1300超凈工作臺 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀器廠;數(shù)碼生物顯微鏡 OLYMPUS CX-21;PCR儀 Applied Biosystems公司;T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 甘薯汁葡萄糖培養(yǎng)基:甘薯200 g洗凈切絲,加入蒸餾水1000 mL煮沸20 min過濾得甘薯汁,加入葡萄糖20 g氯霉素 0.2 g。甘薯汁肉湯培養(yǎng)基:甘薯200 g洗凈切絲,加入1000 mL蒸餾水煮沸20 min過濾得甘薯汁,加入酵母粉5 g,牛肉膏10 g,葡萄糖22 g,無水乙酸鈉5 g,K2HPO42 g。

1.2.2 自然發(fā)酵甘薯酸漿的制備 稱取500 g甘薯洗凈切絲,加入1500 mL涼開水,打漿機調(diào)至3檔運行45 s,間隔30 s,再用3檔打漿30 s,將打出漿過八層紗布后再用120目篩子過濾,得甘薯漿后將其轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的燒杯中,靜置30 min后去除約三分之二上清液,剩余薯漿攪勻,加水至原體積,20～30 ℃發(fā)酵12～24 h,每隔3～4 h攪拌1次[1]。

1.2.3 自然發(fā)酵甘薯酸漿的活化 甘薯榨汁制得甘薯漿,將其加入到1.2.2發(fā)酵的老漿中攪勻,再重復(fù)1.2.1去上清步驟以去除雜質(zhì),每隔24 h活化一次,直至上清液顏色由褐色變成青白色,有少量水沫,味變酸,pH3.5～4.0,且上清液加入甘薯淀粉乳中可快速沉降分層。

1.2.4 酸漿中酵母菌的篩選

1.2.4.1 初篩 采用稀釋平板涂布法,分離純化樣品中的酵母菌。用無菌蒸餾水將活化好的酸漿梯度稀釋為10-5、10-6、10-7三組濃度,各取0.1 mL涂布到氯霉素抗性的(0.2 g/L)PDA平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取典型的酵母菌菌落并鏡檢,將初步判定為酵母菌的菌落接種到PDA平板上劃線分離,30 ℃下培養(yǎng)48 h。如此反復(fù)劃線純化2～3次,根據(jù)各菌落形態(tài),直到確定為單菌落后編號。

1.2.4.2 復(fù)篩 將編好號的菌株接種到甘薯汁葡萄糖培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,活化3代,8000 r/min離心10 min并重懸于無菌蒸餾水洗滌兩次,調(diào)整OD600至0.7備用。

副干酪乳桿菌L1接入甘薯汁肉湯培養(yǎng)基活化3代,30 ℃培養(yǎng)24 h,8000 r/min離心10 min并重懸于無菌蒸餾水洗滌兩次,調(diào)整OD600至0.7。將初篩得到的各株酵母菌分別與副干酪乳桿菌L1兩兩配對。將兩株配對菌的菌懸液各5 mL加入15 mL離心管中,旋渦30 s混勻,于30 ℃孵育24 h后取上清液,在600 nm處測定吸光值并計算共凝集率,公式如下。再從中選出共凝集率最高的菌株,鑒定菌種。

共凝集率(%)=[(OD600A+OD600B)-OD600(A+B)]×100/(OD600A+OD600B)

式中:OD600(A+B)為兩種菌液混合孵育后的吸光值,OD600A和OD600B分別為副干酪乳桿菌L1和酵母菌兩種菌懸液單獨孵育后的吸光值[11]。

1.2.5 酵母菌菌種鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將上述篩選得到的酵母菌劃線接種于PDA平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察其菌落顏色及形態(tài),對該酵母鏡檢,在油鏡下觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5.2 生理生化實驗 糖發(fā)酵實驗:按培養(yǎng)液體積的2%分別加入葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、海藻糖于培養(yǎng)液中,分裝試管后再倒置各加入杜氏管一支,置于30 ℃下培養(yǎng)48 h,不加任何糖源做空白對照;氮源同化實驗:將脲、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨分別加入培養(yǎng)液分裝,不加任何氮源做空白對照,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察試管中是否渾濁;碳源同化實驗:加入碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖、蔗糖,方法同氮源同化實驗[12]。

1.2.5.3 分子生物學(xué)鑒定 提取分離篩選所得的酵母菌DNA,進行PCR擴增26S rDNA,采用引物為26sF:5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′和26sR:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中基因組DNA 1.0 μL,10×Buffer(Mg2+Plus)5.0 μL,Taq聚合酶(5 U/L)1.0 μL,dNTP(10 mmol/L)1.0 μL,正向和反向引物共3.0 μL,加去離子水(ddH2O)39.0 μL至50.0 μL。擴增程序為95 ℃預(yù)熱300 s,98 ℃解鏈30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán)。反應(yīng)完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認(rèn)PCR擴增片段后將PCR產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技公司測序。將測得的基因序列提交到Genebank進行同源性比較,最后用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 理化因素對酵母菌與副干酪乳桿菌L1共凝集特性的影響

1.2.6.1 菌懸液的制備 酵母菌活化后接入PDA液體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)48 h,8000 r/min離心10 min收集菌體,無菌蒸餾水洗滌兩次后重懸,調(diào)菌懸液OD600至0.7左右備用。副干酪乳桿菌L1活化后接入甘薯肉湯汁培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)24 h,8000 r/min離心10 min收集菌體,無菌蒸餾水洗滌兩次后重懸,調(diào)菌液OD600至0.7左右備用。

1.2.6.2 緩沖液 制備菌懸液時,分別采用無菌蒸餾水和PBS(pH=7)重懸并調(diào)菌液OD600值至0.7,酵母菌和乳酸菌分別設(shè)置單菌對照,30 ℃靜止孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據(jù)1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數(shù)據(jù)。

1.2.6.3 溫度 將菌懸液調(diào)OD600值至0.7,單菌對照,分別置于20、35、50、65 ℃下孵育,在4、24 h取上清液測OD600,根據(jù)1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數(shù)據(jù)。

1.2.6.4 pH 將離心收集的菌體用pH分別為3、5、7、9的無菌蒸餾水重懸沉淀,制備成不同pH環(huán)境下的菌懸液。調(diào)菌液OD值至0.7,單菌對照,30 ℃靜止孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據(jù)1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數(shù)據(jù)。

1.2.6.5 超聲處理 將菌懸液調(diào)OD600至0.7,置于100 W超聲振蕩器中振蕩30 s,與靜置組互為對照,30 ℃靜置孵育,分別在4、24 h取上清液測OD600,根據(jù)1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數(shù)據(jù)。

1.2.6.6 生長期 酵母菌培養(yǎng)時間分別取12、24、36、48 h共4組,副干酪乳桿菌L1均培養(yǎng)24 h,其余條件不變,根據(jù)1.2.4.2的測定方法計算共凝集率,處理數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件中的ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和差異顯著性分析(p<0.05),數(shù)據(jù)的表示方式為:平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化、篩選及形態(tài)學(xué)鑒定

從活力良好的自然發(fā)酵甘薯酸漿中,采用PDA培養(yǎng)基從樣品中共分離出88株酵母菌,通過菌落和形態(tài)觀察及參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]對酵母菌進行初步鑒定,再通過測定共凝集率篩出與副干酪乳桿菌L1共凝集率最高的一株菌9#,其共凝集率為67.2%±0.12%。如圖1a,該菌菌落呈乳白色,菌落表面光滑濕潤,邊緣整齊,橢圓微凸。圖1b菌個體呈長圓形,鏡檢時有明顯芽殖現(xiàn)象,圖1c、圖1d可見該菌與副干酪乳桿菌L1明顯的黏附現(xiàn)象。

圖1 9#酵母菌形態(tài)及共凝集狀態(tài)

2.2 生理生化實驗

同化實驗反映酵母菌菌種對不同碳源和氮源的利用能力,糖發(fā)酵實驗反映了酵母菌對糖的利用能力。表1可以看出,9#菌可以發(fā)酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和海藻糖,不能發(fā)酵木糖;該菌可以同化葡萄糖、果糖和蔗糖,但不能同化木糖、麥芽糖和乳糖;該菌可以同化硫酸銨、氯化銨、蛋白胨和脲。通過以上實驗結(jié)果,結(jié)合《酵母菌的特征和鑒定手冊》[13]可初步判斷9#菌為畢赤酵母屬。

表1 9#菌與乳酸菌的糖發(fā)酵與同化能力

2.3 分子生物學(xué)鑒定

26S rDNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。26S rDNA的D1/D2區(qū)域位于大亞基的5′端,序列長度在600 bp左右。目前大多數(shù)酵母菌模式菌株的26S rDNA已被測定并公布,所以26S rDNA 的D1/D2區(qū)域可作為酵母菌種級水平的鑒定依據(jù)[14]。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖

在NCBI經(jīng)Blast比對,9#菌與Meyerozymaguilliermondii相似性達(dá)到100%。利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖3所示。

圖3 利用26S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)合其菌體的個體、群體形態(tài)特征,生理生化實驗結(jié)果及菌株的26S rDNA 分子測序結(jié)果,確定9#菌為季也蒙氏畢赤酵母(M.guilliermondii),命名為M.guilliermondiiJ616。

2.4 酵母菌與副干酪乳桿菌L1的共凝集特性

2.4.1 緩沖液對兩株菌共凝集能力的影響 由圖4可以看出,采用不同的緩沖液制成菌懸液后,在4 h時,蒸餾水組的共凝集率為42.5%,PBS組為41.3%,差異不顯著(p>0.05),24 h后,蒸餾水組達(dá)到68.8%,而PBS組為60.2%,共凝集率顯著升高(p<0.05),故無菌蒸餾水更適合做共凝集時的分散劑。造成這種結(jié)果的原因可能是PBS中的離子干擾了兩株菌表面共凝集因子互相結(jié)合。與PBS相比,蒸餾水對這種作用影響不大。

圖4 緩沖液對共凝集率的影響

2.4.2 孵育溫度對兩株菌共凝集能力的影響 由圖5可知,4 h時各實驗組共凝集率差異顯著(p<0.05),其中35 ℃組共凝集率最高,達(dá)到52.6%,20 ℃組共凝集率最低為43.1%;24 h時不同溫度條件下兩株菌的共凝集率差異顯著(p<0.05),35 ℃組共凝集率最高,達(dá)到72.7%,65 ℃組最低,共凝集率為58.4%。可以看出,與35 ℃組相比,高溫和低溫環(huán)境對共凝集均有抑制作用,這表明共凝集因子可能包含某種蛋白,環(huán)境溫度對其發(fā)揮作用有重要影響。

圖5 溫度對共凝集率的影響

2.4.3 pH對兩株菌共凝集能力的影響 由圖6可以看出,在不同pH下,共凝集率變化較差異顯著(p<0.05)。當(dāng)pH為5.0時,無論是4 h組還是24 h組,其共凝集率都是最高的,分別為52.8%和70.4%,當(dāng)pH為酸性(pH<7)時,其共凝集率高于堿性(pH>7)環(huán)境,這表明酸性環(huán)境可促進共凝集率升高。在張明[1]的研究中,副干酪乳桿菌L1在pH為5.0左右時對甘薯淀粉有較好的沉降效果,這進一步表明副干酪乳桿菌L1與淀粉絮凝的結(jié)合位點可能與酵母菌的共凝集因子有某種聯(lián)系,但其詳細(xì)的作用機理仍需深入研究。

圖6 pH對共凝集率的影響

2.4.4 超聲處理對兩株菌共凝集能力的影響 超聲處理的目的是將兩株菌的細(xì)胞在懸浮液打散,使其分布得更加均勻。由圖7可以看出,超聲處理后兩株菌共凝集率普遍提高,且4 h組和24 h組都差異顯著(p<0.05)，超聲處理條件下孵育時間24 h時，兩株菌共凝聚率為74.8%。這說明超聲處理后,兩種共凝集菌細(xì)胞可以充分接觸,使得共凝集更為強烈。

圖7 超聲處理對共凝集率的影響

2.4.5 生長期對兩株菌共凝集能力的影響 由圖8可以看出,不同生長期的酵母菌對共凝集率的影響4 h組和24 h組差異都不顯著(p<0.05)。不同生長期的酵母菌與副干酪乳桿菌L1共同孵育后,4 h后共凝集率穩(wěn)定在47%左右,24 h后共凝集率穩(wěn)定在70%左右。這說明不同時期的酵母菌并沒有影響共凝集的強度,這與王海超[15]的研究結(jié)果一致,表明了酵母菌在不同時期的代謝產(chǎn)物沒有參與到共凝集反應(yīng)中,其參與共凝集反應(yīng)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)不是隨菌體生長時期的變化而產(chǎn)生的,而是和菌體生長呈平行關(guān)系,遺傳穩(wěn)定性大。

圖8 生長期對共凝集率的影響

3 結(jié)論

本研究在自然發(fā)酵的甘薯酸漿中,采用PDA固體培養(yǎng)基平板涂布法分離、純化,篩選出一株促進副干酪乳桿菌L1絮凝淀粉的酵母菌。經(jīng)生理生化實驗和26S rDNA分子測序鑒定,確定該酵母菌為季也蒙氏畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii),并命名為M.guilliermondiiJ616。以副干酪乳桿菌L1與M.guilliermondiiJ616共凝集率為指標(biāo),確定了孵育前用無菌蒸餾水作緩沖液、超聲分散處理,孵育pH為5、溫度為35 ℃,這四種因素均可促進M.guilliermondiiJ616與副干酪乳桿菌L1共凝集。但不同生長期的酵母菌對共凝集沒有顯著影響。這為研究乳酸菌與酵母菌之間的相互作用關(guān)系提供理論依據(jù),并為微生物絮凝劑的開發(fā)提供技術(shù)參考。