金花葵花黃酮提取物不同溶劑萃取物的抗氧化活性

李現(xiàn)日,張 杰,張英美,金太文,康明秀,袁其朋

(1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100029;2.金亨稷師范大學(xué),平壤 999093;3.金日成綜合大學(xué),平壤 999095)

金花葵(Aureahelianthus)又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉,為錦葵科,秋葵屬,一年生草本植物,在200多種秋葵植物中最具有食用、藥用、保健等功能,有較高的商業(yè)價(jià)值[1]。研究發(fā)現(xiàn),金花葵的花、莖、葉、種子中都含有豐富的生物活性物質(zhì),具有良好的抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保肝等功能[2]。目前,針對(duì)金花葵中活性物質(zhì)的主要研究為金花葵中多糖提取及其抗氧化活性研究[2-5]、金花葵中黃酮多種提取方法研究(有機(jī)溶劑回流提取、索式提取及輔助提取)[6-10],但關(guān)于不同溶劑對(duì)金花葵花中黃酮的萃取及萃取物的活性研究尚未報(bào)道。為了深入研究不同極性溶劑對(duì)金花葵花中黃酮萃取及活性的影響,本文對(duì)金花葵花黃酮乙醇提取物進(jìn)行溶劑分級(jí)萃取,采用DPPH自由基法、羥基自由基法、還原能力法、超氧陰離子能力法和油脂抗氧化作用法,對(duì)不同萃取物進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn),分析抗氧化活性與各萃取物中黃酮含量的關(guān)系。以期為進(jìn)一步開發(fā)和發(fā)展金花葵花中的黃酮提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花葵花 購自北京順義;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純,北京化學(xué)試劑廠;硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、水楊酸、過氧化氫、硫代巴比妥酸、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸等 均為國產(chǎn)分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;CA-1115A型冷卻水循環(huán)裝置 上海愛朗儀器有限公司;BT-255電子分析天平 德國Sartorius公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金花葵花不同萃取物的制備 采用宋琳琳等[7]的方法,略有改動(dòng)。金花葵花自然干燥5 d,粉碎,過80目篩,4 ℃?zhèn)溆谩７Q取金花葵花粉末10.00 g,每次用75%乙醇200 mL 70 ℃水浴回流提取2 h,共三次,合并提取液,經(jīng)減壓濃縮得浸膏。

采用云成悅等[11]的方法,萃取流程如圖1。先將乙醇提取浸膏用0.5 L去離子水溶解,后加入0.25 L的石油醚進(jìn)行振蕩,靜置20 min,待完全分層后收集上層的石油醚相,下層水相按上述方法再萃取四次;剩余水相按上述步驟依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,依次得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液及最后的水相溶液,將相同萃取劑的萃取液合并進(jìn)行減壓濃縮,得萃取物浸膏,然后置于干燥器中。將金花葵花各萃取物用去離子水配制不同濃度梯度(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)的萃取物溶液,用于后續(xù)抗氧化活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

圖1 金花葵花不同萃取物的制備流程

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 采用Viacava等[12]的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法,略有改動(dòng)。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品8.00 mg,置于50 mL 量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度搖勻,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品初始液。精密吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品初始液,分別置于10 mL 容量瓶中,加70%乙醇稀釋至5.0 mL,加入0.4 mL 5% NaNO2搖勻,靜置6 min,加入0.4 mL 10% Al(NO3)3搖勻,靜置6 min,加入0.4 mL 4% NaOH,最后加去離子水定容10 mL,搖勻后靜置15 min,在 λ=510 nm處測(cè)定吸光度A。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=2.4254X-0.0273(R2=0.9996),把測(cè)定樣品吸光值代入方程,得到總黃酮含量。

1.2.3 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 采用Priyanka等[13]的方法,略有改動(dòng)。用去離子水配制不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的各萃取物溶液,并用抗壞血酸(VC)溶液作為對(duì)照。取樣品溶液0.5 mL,加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH無水乙醇溶液,混勻室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定樣品吸光度Ai,空白組Aj以等量去離子水代替DPPH溶液,對(duì)照組VC以等量去離子水代替樣品溶液,平行測(cè)定3次,取平均值。清除率計(jì)算公式如式(1)。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

式中:Ac對(duì)照組吸光值;Ai樣品溶液的吸光值;Aj空白組吸光值。

1.2.3.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定 采用Chen[14]的方法,略有改動(dòng)。原理基于H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。在10 mL的試管中依次加入2 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液,2 mL不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的萃取物溶液,VC溶液作為對(duì)照,加入1 mL 8 mmol/L H2O2溶液混勻啟動(dòng)反應(yīng),室溫靜置10 min,最后加入2 mL 5 mmol/L的水楊酸溶液作為捕獲劑,混勻并靜置30 min后,取適量上清液,510 nm測(cè)吸光度Ai,空白組Aj以等量去離子水代替水楊酸溶液,對(duì)照組Ac以等量去離子水代替樣品溶液。平行測(cè)定3次,取平均值。清除率計(jì)算公式如式(2)。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(2)

式中:Ac對(duì)照組吸光值;Ai樣品溶液的吸光值;Aj空白組吸光值。

1.2.3.3 還原能力的測(cè)定 采用Yildirim等[15]的鐵氰化鉀還原法,略有改動(dòng)。不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的各萃取物溶液和VC溶液作為對(duì)照,分別取不同濃度梯度的溶液2 mL,加入2 mL pH=6.6 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min。水浴結(jié)束后加入2 mL 10%的三氯乙酸,混勻后3000 r/min離心10 min。取上清液2 mL加入試管中,再依次加入2 mL去離子水以及0.5 mL 0.1%三氯化鐵在試管中,混勻反應(yīng)10 min,在700 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3.4 清除超氧陰離子能力的測(cè)定 采用Liang等[16]的方法,略有改動(dòng)。取5 mL 0.1 mol/L pH=8.2 Tris-HCl的緩沖液與0.5 mL不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL各萃取物溶液及VC溶液,用去離子水補(bǔ)充至9.5 mL,置于10 mL比色管中混勻,25 ℃水浴20 min,取出后立即加入0.5 mL在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚,迅速搖勻后倒入比色皿中,用4 mL 10 mmol/L HCl為空白液,在320 nm波長處,每隔30 s測(cè)吸光度一次,共計(jì)4 min,以吸光值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作線性關(guān)系圖,斜率即為Vt,計(jì)算出抗氧化劑對(duì)超氧陰離子的清除率。清除率計(jì)算公式如式(3)。

清除率(%)=[1-V1/V0]×100

式(3)

式中:V1樣品吸光值斜率;V0鄰苯三酚吸光值斜率。

1.2.3.5 油脂抗氧化作用的測(cè)定 采用劉丹丹等[17]方法,略有改動(dòng)。硫代巴比妥酸(TBA)法是目前測(cè)定脂質(zhì)過氧化常用的方法。脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸被氧化為過氧化脂質(zhì),后期生成大量的丙二醛(MDA),其可與TBA 縮合,在pH=3.0時(shí)顯粉紅色,在532 nm 處有特征吸收,可根據(jù)吸光度值A(chǔ)判斷脂質(zhì)過氧化的程度。分別將2 mL 1.00 mg/mL的萃取物、VC和去離子水置于具塞錐形瓶中,依次加2 mL 2.5% 亞油酸溶液,4 mL pH=7.4 0.05 mol/L PBS緩沖溶液,2 mL去離子水,0.5 mL 5 mmol/L H2O2,以無水乙醇作為對(duì)照?；靹蚝笾糜?7 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每隔24 h取1 mL樣品,加入1 mL 10%三氯乙酸,靜置20 min,加入1 mL 0.3%硫代巴比妥酸溶液,混勻后沸水浴加熱20 min,室溫下冷卻后加入2 mL正丁醇,充分搖勻,3000 r/min離心15 min,取上清液于532 nm測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用Origin 8.0和SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性溶劑萃取物的質(zhì)量及黃酮含量

不同極性溶劑萃取物的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,提取物中極性大的成分較多,故萃取物質(zhì)量:乙醇提取物>水相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相。不同極性溶劑萃取物中黃酮含量如圖3所示。由圖3可知,金花葵花乙醇提取物經(jīng)不同極性溶劑分級(jí)萃取后,各萃取相中黃酮含量差異明顯,黃酮含量順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相。黃酮含量范圍為11.5%～48.3%,乙酸乙酯相和正丁醇相中黃酮含量顯著高于其它組(p<0.05)。其中乙醇提取物中黃酮含量為30.4%,乙酸乙酯相中黃酮含量為48.3%,黃酮含量提高倍數(shù)約為1.6倍,接近金花葵花黃酮經(jīng)聚酰胺樹脂純化1.9倍[9]。液-液萃取法是近年來備受關(guān)注的純化技術(shù),不僅在一定程度上提高了純度,還具有高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。

圖2 不同萃取物質(zhì)量的比較

圖3 不同萃取物黃酮含量的比較

2.2 不同極性溶劑萃取物體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 DPPH自由基清除能力 由圖4可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,清除率也相應(yīng)地增加。同一濃度下,各萃取物對(duì)DPPH自由基的清除順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢(shì)一致。比較VC與各萃取物,發(fā)現(xiàn)VC、乙酸乙酯相、正丁醇相對(duì)DPPH清除能力顯著高于其它萃取物(p<0.05)。各萃取物濃度為1.00 mg/mL時(shí),其清除率分別為乙酸乙酯相97.5%、正丁醇相96.8%、乙醇提取物87.3%、石油醚相82.2%、水相81.3%。金花葵花各萃取物清除DPPH自由基的機(jī)理是其具有供氫體,可以提供質(zhì)子還原具有氧化性的自由基,終止自由基的連鎖反應(yīng),從而起到抑制或清除自由基的作用[20]。

圖4 金花葵花不同極性溶劑萃取物清除DPPH自由基能力

2.2.2 羥基自由基清除能力 由圖5可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對(duì)羥基自由基的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,羥基自由基清除率隨之升高。同一濃度下,各萃取物對(duì)羥基自由基的清除順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢(shì)一致。比較VC與各萃取物,發(fā)現(xiàn)VC、乙酸乙酯相、正丁醇相對(duì)羥基自由基清除能力顯著高于其它萃取物(p<0.05),尤其是乙酸乙酯相清除能力僅次于VC。各萃取物質(zhì)量濃度1.00 mg/mL時(shí),其清除率分別為乙酸乙酯相92.5%、正丁醇相90.8%、乙醇提取物81.3%、石油醚相70.5%、水相68.3%。

圖5 金花葵花不同極性溶劑萃取物清除羥基自由基能力

2.2.3 金花葵花各萃取物的還原能力 由圖6可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物的還原能力存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物質(zhì)量濃度的增加,還原能力也相應(yīng)地增加。各萃取物還原能力順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢(shì)一致。乙酸乙酯相和正丁醇相還原能力顯著高于其它相(p<0.05)。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),金花葵花各萃取物的還原產(chǎn)物的吸光度分別為乙酸乙酯相2.48 Abs、正丁醇相2.26 Abs、乙醇提取物1.73 Abs、石油醚相1.32 Abs、水相1.28 Abs。

圖6 金花葵花不同極性溶劑萃取物的還原能力

2.2.4 超氧陰離子清除能力 由圖7可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對(duì)超氧陰離子的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,超氧陰離子清除率隨之升高,與其黃酮含量趨勢(shì)一致。金花葵花各萃取物清除超氧陰離子能力不同,在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯和正丁醇相清除超氧陰離子的能力分別為97.2%、96.8%,顯著高于石油醚相和水相的68.5%、63.1%(p<0.05)。

2.2.5 抗油脂氧化能力 丙二醛為油脂過氧化的次級(jí)產(chǎn)物,油脂在氧化初期,丙二醛的產(chǎn)量隨著氧化程度加深而增加。丙二醛顯色測(cè)定法與丙二醛產(chǎn)量密切相關(guān),因此在油脂氧化初期,次級(jí)代謝產(chǎn)物較少會(huì)影響丙二醛顯色法的顯色,氧化后期時(shí)丙二醛累積較為充足,顯色變化較為明顯,測(cè)定較為準(zhǔn)確[21]。金花葵花各萃取物添加量均為0.1%亞油酸時(shí),各萃取物的抗油脂氧化能力如圖8所示。亞油酸的丙二醛吸光值與時(shí)間呈正相關(guān),即時(shí)間越長,丙二醛吸光值越大。各萃取物抗油脂氧化能力均顯著高于對(duì)照亞油酸(p<0.05),即丙二醛吸光值越小,抗氧化能力越強(qiáng)。各萃取物抗油脂氧化能力順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,尤其是乙酸乙酯相、正丁醇相有較強(qiáng)的抗油脂氧化作用,并且和VC抗油脂氧化能力相近。綜合以上結(jié)果,說明金花葵花各萃取物均具有抗油脂氧化能力,能有效延緩食用油脂的脂質(zhì)過氧化,其中乙酸乙酯相和正丁醇相效果顯著,這可能是跟萃取物中黃酮含量有關(guān)[22]。綜合以上結(jié)果,金花葵花各萃取物中黃酮含量越多,其抗油脂氧化能力越強(qiáng)[23]。

2.3 抗氧化活性指標(biāo)間的相關(guān)性分析

利用SPSS軟件對(duì)金花葵花各萃取物的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí),進(jìn)行了五種抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性分析,結(jié)果見表1。從表1可知,還原能力與DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力、抗油脂氧化能力呈極顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)在0.969～0.995之間(p<0.01)。綜合看來,金花葵花各萃取物對(duì)五種體系的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果基本一致,存在的些微不同一方面可能是因?yàn)樘崛〉玫降狞S酮是混合物,抗氧化活性成分較為復(fù)雜;另一方面可能是因?yàn)椴煌寡趸笜?biāo)的檢測(cè)機(jī)理不同[24]。

表1 五種抗氧化活性指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 總黃酮含量與抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性分析

金花葵花各萃取物的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí),其黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性見表2。從表2可知,總黃酮含量與還原力、清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的能力和油脂抗氧化作用顯著相關(guān)性(p<0.05),相關(guān)系數(shù)在0.937～0.980之間,說明金花葵花黃酮具有較高的體外抗氧化能力。黃酮結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu),使得黃酮具有較強(qiáng)捕捉自由基的能力和抗氧化活性,并且抗氧化活性強(qiáng)弱與其黃酮含量、種類、結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。

表2 萃取物黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本文對(duì)金花葵花黃酮乙醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取,而后對(duì)各萃取物的清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力、還原能力、清除超氧陰離子能力和油脂抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定,研究金花葵花黃酮不同極性溶劑萃取物的體外抗氧化能力。研究表明,金花葵花黃酮得到較好地分離(11.5%～48.3%),其中乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物中黃酮含量顯著高于其它相(p<0.05),且具有較好的抗氧化能力。在0.20～1.00 mg/mL的萃取物質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,抗氧化能力相應(yīng)增大。萃取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相和正丁醇相的抗氧化能力接近VC。抗氧化活性檢測(cè)方法之間相關(guān)系數(shù)為0.969～0.995(p<0.01),萃取物中黃酮含量與抗氧化活性之間相關(guān)系數(shù)為0.937～0.980(p<0.05),說明金花葵花黃酮具有較高的體外抗氧化能力。綜上所述,乙酸乙酯和正丁醇的萃取物抗氧化能力較好,可作為分離抗氧化活性物質(zhì)的重點(diǎn),為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)為金花葵花的綜合開發(fā)和利用奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。