60 Hz低頻電磁場對α-淀粉酶催化效率的影響及作用機理

楊 慧,林日輝,*,樊艷葉,廖安平,蔡杏華,韋世昌,廖成超

(1.廣西民族大學化學化工學院,廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地,廣西高校化學與生物轉化過程新技術重點實驗室,廣西南寧 530006;2.廣西民族大學海洋與生物技術學院,廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室,廣西南寧 530006;3.廣西民族大學相思湖學院,廣西南寧 530006)

淀粉的水解產物主要有糊精、麥芽糖、葡萄糖[1],其中葡萄糖廣泛應用于工業、食用及醫藥等領域[2-3]。國內外比較常用的淀粉糖化工藝主要有3種:酸法、酶解法及酸酶法[4-5],其中酶解法具有反應條件溫和,設備簡單,催化效率高,產品純度高等優點[5]。目前,酶法制備淀粉水解糖普遍存在反應時間長、能耗及生產成本高等問題[3,5],因此,提高酶促反應效率,有效縮短淀粉水解反應時間具有現實意義。劉洪等[5]報道微波-雙酶耦合催化淀粉的水解率比水浴加熱提高20%以上。石文奇等[6]在超聲波對液體α-淀粉酶酶學活性的影響研究中,利用適當的超聲波處理α-淀粉酶,其酶活性最大可提高13%,退漿率提高約10.2%。但微波和超聲波的機械強度過高,容易破壞酶的活性中心,使酶失活,而且由于微波的熱效應難以有效控制及超聲波的衰減因素的制約,微波和超聲波難以應用于工業大規模生產。

低頻電磁場(low frequency electromagnetic field,LF-EMF)是指頻率在0～300 Hz范圍內的交變電磁場,其中工頻電磁場(50～60 Hz)是在LF-EMF中應用最為廣泛一類電磁場[7]。薛麗萍等[8]利用低電頻電磁場對過氧化氫酶進行處理,酶活性及酶構象均發生改變,當處理溫度為55 ℃時,最高酶活可提高100%以上,其二級結構向α-螺旋轉變。張秋霞等[9]發現用0.1 T的磁場處理脂肪酶1 h可使酶活力提高76.1%。肖祖峰等[10]認為電磁場可降低傳質過程的活化能,強化擴散。

本實驗室前期研究中發現,在頻率為60 Hz低頻電磁場作用下,釀酒酵母生長速率提高了14.52%,葡萄糖消耗加快了15.6%,胞內乙醇脫氫酶(ADH)和超氧化物歧化酶(SOD)的比活力分別提高了7.25%和43.18%,有效促進釀酒酵母的生長代謝[11]。目前利用LF-EMF提高酶促反應效率的研究鮮見報道,且提高催化效率,縮短反應時間,降低能耗一直是工業上對酶制劑應用的追求目標,所以為了拓展LF-EMF的應用范圍,提高酶催化效率,探索LF-EMF的作用機理,本文以α-淀粉酶催化水解玉米淀粉為研究對象,在反應過程中加入頻率為60 Hz LF-EMF,探討LF-EMF輻射對α-淀粉酶催化效率的影響,并進一步分析LF-EMF輻射對玉米淀粉的形貌及結晶度、α-淀粉酶結構及傳質過程等方面的影響,探究LF-EMF的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 食品級,廣西南寧旺蜀商貿有限責任公司;α-淀粉酶(≥500 KNU/g)生物試劑 阿拉丁試劑(上海)有限公司;3,5-二硝基水楊酸、濃鹽酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;氯化鈉 分析純,天津市博迪化工有限公司;Tris堿 分析純,北京索萊寶科技有限公司;N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺 分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司;檸檬酸 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;磷酸氫二鈉 分析純,天津市大茂化學試劑廠。

電場發生裝置(DENBA～08,功率為3.3 W,頻率為60 Hz,電場強度為2.5 mV/m,有效輻射范圍8 m3) 日本株式會社;SUPRA 55 Sapphire場發射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;UItime IV組合型X射線衍射儀 日本理學公司;L400型高速冷凍離心機、F-700型熒光光度計 日本日立公司;WIX-miniPR02型垂直電泳槽 韋克斯科技有限公司;EPS301型電泳儀 瑞士Amershan Biosciences公司;GeIDOC XR凝膠電泳成像分析系統 美國BIO RAD公司;Chirascanq CD圓二色CD光譜儀 英國應用光物理公司;MQL-61R立式振蕩培養箱 上海旻泉儀器有限公司;DDS-307型電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LF-EMF對α-淀粉酶催化效率的影響 實驗設置輻射及對照兩組(每個實驗樣品設三個平行),輻射反應組采用60 Hz LF-EMF進行輻射(放入搖床前開啟輻射),對照組則不作輻射處理。實驗組與對照試驗的反應體系均含玉米淀粉1.00 g,50 mmol/L pH為6.4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液50 mL,置于150 mL錐形瓶,加入α-淀粉酶100 μL在150 r/min,40 ℃恒溫搖床中反應。

采用DNS法測定水解產生的葡萄糖濃度[12-13],每隔2 h取樣1 mL,8000 r/min離心5 min,取上清100 ℃水浴加熱3 min,經無菌水稀釋相應倍數,然后按照1∶1的體積之比與DNS試劑充分混勻,100 ℃水浴加熱5 min,冷卻至室溫后,在540 nm波長下檢測吸光值。葡萄糖的濃度計算根據標準曲線y=7.456x-0.3676(R2=0.9995)。

1.2.2 LF-EMF對玉米淀粉結構的影響 以蒸餾水代替反應體系的α-淀粉酶,在LF-EMF輻射下分別處理12、24 h,5000 r/min離心5 min,沉淀于60 ℃烘箱中烘干。將LF-EMF輻射處理淀粉與原淀粉制成電鏡觀察樣品,采用場發射掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品表面形態進行對比分析;采用X射線衍射儀對樣品進行XRD表征,CuKa射線,Ni濾波,管電壓40 kV,管電流15 mA,掃描速率8(°)/min,掃描范圍4～60 °;參照陳翠蘭等[14]的方法計算樣品的相對結晶度,對比結晶度變化。

1.2.3 LF-EMF處理對α-淀粉酶結構的影響 為了研究LF-EMF輻射是否對酶結構造成影響,對α-淀粉酶進行LF-EMF處理后,進行聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)、圓二色譜(circular dichroism,CD)及熒光光譜分析。

1.2.3.1 LF-EMF對α-淀粉酶一級結構的影響 將LF-EMF輻射處理的α-淀粉酶液與原酶液稀釋至相同濃度(0.15 mg/mL),通過SDS-PAGE電泳[15]分析,分離膠濃度為12%(分離范圍12～150 kDa),濃縮膠濃度為5%,上樣量為10 μL,預電泳電壓80 V,進入分離膠后調到120 V,用0.25%的考馬斯亮藍R 250染色1 h,脫色過夜。電泳結果采用凝膠成像儀進行拍照和分析。

1.2.3.2 LF-EMF對α-淀粉酶二級結構的影響 用pH6.4,5 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制0.4 mg/mLα-淀粉酶溶液,分別進行LF-EMF輻射處理與非LF-EMF輻射處理對照,在處理時間為6、12、24 h時分別取樣0.5 mL,參考文獻[16]運用圓二色譜儀檢測α-淀粉酶的CD圖譜。利用CDpro軟件計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲所占比例。

1.2.3.3 LF-EMF對α-淀粉酶三級結構的影響 用pH6.4,50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制0.008 mg/mLα-淀粉酶溶液。分別進行LF-EMF輻射處理與非LF-EMF輻射處理對照,在處理時間為6、12、24 h時分別取樣1 mL,參照文獻[17]記錄激發波長為278 nm和發射波長298～436 nm波長范圍內的熒光光譜。

1.2.4 LF-EMF下不同離子強度對α-淀粉酶催化效率的影響 電磁場可改變帶電粒子的運動狀態,提高動能[18],因此,反應體系中的離子強度可能對LF-EMF作用于酶促反應產生影響。為此,本文通過調整反應體系的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液濃度[19-20],使反應體系離子強度分別設置為0.0047、0.0237、0.0474、0.0947、0.1894、0.2841、0.4735 mol/L,其他反應條件同1.2.1(每個實驗樣品設三個平行),進行酶促淀粉水解反應。反應4 h后取樣檢測葡萄糖濃度,分析不同離子強度下LF-EMF對α-淀粉酶催化玉米淀粉水解效率的影響差異。

1.2.5 LF-EMF對傳質的影響 參考文獻[21-22]以氯化鈉在溶液中的擴散為模型進一步探究LF-EMF對傳質的影響。準確稱量10 g NaCl固體于稱量瓶(?40 mm×25 mm)內,以飽和食鹽水裝滿,使之呈過飽和狀態,用12000 kDa透析膜封口,將稱量瓶輕柔置于裝有500 mL蒸餾水的500 mL燒杯中。隨機分成兩組(每組3個平行),一組處于LF-EMF持續輻射,另一組為自然狀態的自由擴散,每隔0.5 h用電導率儀檢測液面以下1 cm電導率值,分析LF-EMF輻射對離子擴散的影響。

1.2.6 數據處理 所有實驗均進行三次重復,采用Excel 2010進行實驗數據統計,采用Origin(Pro 9.0)軟件對實驗參數和結果進行擬合分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 LF-EMF對α-淀粉酶催化效率的影響

如圖1所示,在反應時間內,LF-EMF輻射顯著提高α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的反應效率(p<0.05)。當反應時間為10 h時,LF-EMF輻射條件下淀粉水解產葡萄糖為14.39 mg/mL,比對照提高了15.90%。說明LF-EMF輻射提高了α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的效率。

圖1 LF-EMF對α-淀粉酶水解玉米淀粉反應的影響

2.2 LF-EMF對玉米淀粉結構的影響

由圖2、圖3所示:電鏡圖顯示玉米淀粉經LF-EMF輻射處理12、24 h后,表面光滑、平整、結構緊密并未發生破裂,與原玉米淀粉對比無明顯差別。XRD分析顯示LF-EMF輻射處理的玉米淀粉與原淀粉在衍射圖譜上無明顯區別;經計算,LF-EMF輻射處理12、24 h玉米淀粉與原淀粉的結晶度分別為26.92%、26.57%及26.74%,結晶度無顯著變化(p>0.05)。該結果表明LF-EMF輻射對玉米淀粉的形貌及晶體結構均無顯著影響,說明LF-EMF輻射對酶促水解的促進作用并非改變底物淀粉形貌或結構所致。

圖2 玉米淀粉的電鏡圖(500×)

圖3 玉米淀粉的XRD圖

2.3 LF-EMF對α-淀粉酶結構的影響

2.3.1 LF-EMF對α-淀粉酶一級結構的影響 如圖4所示:經LF-EMF輻射處理12 h及24 h后,α-淀粉酶在SDS-PAGE均顯示只有一條蛋白帶,其位置與原α-淀粉酶一致,分子質量約為60 kDa,表明經LF-EMF處理后,α-淀粉酶的肽鏈并未發生降解或聚合,α-淀粉酶的一級結構并沒有受到顯著影響[23]。LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進作用并非由于改變催化劑α-淀粉酶的一級結構所致。

圖4 α-淀粉酶SDS-PAGE電泳分析

2.3.2 LF-EMF對α-淀粉酶二級結構的影響 圓二色光譜(CD)是研究溶液中蛋白質構象的一種重要手段,具有不同二級結構的蛋白質或多肽所產生CD譜帶的位置及吸收的強弱都不相同[23]。對比分析了經LF-EMF處理的α-淀粉酶及對照酶的CD光譜圖,結果如圖5所示。可見,經LF-EMF處理6、12、24 h的α-淀粉酶CD光譜圖均未見特殊吸收峰出現,與未進行LF-EMF處理的對照酶譜圖的基本一致。利用CDpro軟件計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲所占比例見表1,計算結果顯示α-淀粉酶的主要二級構象為β-折疊和無規則卷曲,占比均在30%以上,經LF-EMF處理的α-淀粉酶及對照酶的四種二級構象均無顯著變化(p>0.05)。

圖5 α-淀粉酶的CD光譜圖

表1 α-淀粉酶的二級結構含量

2.3.3 LF-EMF對α-淀粉酶三級結構的影響 實驗進一步以熒光光度儀分析了LF-EMF對α-淀粉酶結構的影響,結果見圖6。α-淀粉酶的最大發射波長為340 nm,經LF-EMF處理6、12、24 h后的α-淀粉酶其最大發射波長均未發生移位,表明酶蛋白熒光發色基團周圍的微環境沒有發生改變;與對照相比,經LF-EMF處理6、12、24 h的α-淀粉酶在熒光發射峰的峰高與峰形上均未見顯著改變(p>0.05)。

圖6 α-淀粉酶的熒光譜圖

上述LF-EMF輻射處理未發現對α-淀粉酶分子的圓二色光譜及熒光光譜造成影響有兩種可能性。一是在實驗輻射強度及處理時間內,LF-EMF輻射確實不能影響或破壞酶分子上的氫鍵等次級鍵,不會對酶分子的高級構象產生影響,LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進作用并非由于改變催化劑α-淀粉酶的分子構象所致。第二種可能是:LF-EMF輻射會一定程度對影響α-淀粉酶的高級構象,但其作用相對較弱,一旦脫離輻射區,酶分子將迅速恢復其天然構象,表現為圓二色光譜及熒光光譜檢測時未出現變化。此時,不能排除LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進作用為改變α-淀粉酶的分子構象所致的可能性。

2.4 LF-EMF下不同離子強度對α-淀粉酶催化效率的影響

為進一步探討LF-EMF輻射對促進α-淀粉酶水解玉米淀粉的作用機制,實驗分析了LF-EMF輻射下不同離子強度對α-淀粉酶的催化效率,結果見圖7。可見,在離子強度0.0047～0.4735 mol/L范圍內,離子強度對α-淀粉酶催化淀粉水解反應具有相似的趨勢:在離子強度達到0.0947 mol/L前,提高反應體系的離子強度對酶促反應具有促進作用,高于離子強度為0.0947 mol/L則對酶促反應產生抑制作用,張春玲等[24]關于大麥發芽過程中金屬離子對大麥酶系中淀粉酶活力影響的研究也報道相似的結果。但是,LF-EMF輻射下不同離子強度對α-淀粉酶催化效率的影響與對照實驗具有顯著差異(p<0.05),主要表現在一下三個方面。第一,LF-EMF條件降低了α-淀粉酶最適離子強度。在實驗條件下,非LF-EMF輻射下最適離子強度為0.0947 mol/L,LF-EMF輻射使之降至0.0474 mol/L。第二,在低離子強度條件下,LF-EMF輻射對離子提高酶活的影響具有強化作用。其中,反應體系離子強度由0.0047 mol/L提高至0.0237 mol/L時,非LF-EMF輻射下,反應體系葡萄糖濃度由(4.90±0.05) mg/mL提高至(4.99±0.06) mg/mL,α-淀粉酶的催化效率提高了1.84%;LF-EMF輻射下反應體系葡萄糖濃度則由(4.91±0.06) mg/mL提高至(5.29±0.02) mg/mL,催化效率提高了7.74%。第三,LF-EMF條件降低了高離子強度對α-淀粉酶的抑制作用。將反應體系離子強度由0.0947 mol/L提高至0.2841 mol/L時,非LF-EMF輻射下,反應體系葡萄糖濃度由(5.31±0.06) mg/mL降至(5.02±0.004) mg/mL,α-淀粉酶的催化效率降低了5.46%;LF-EMF輻射條件下反應體系葡萄糖濃度則由(5.45±0.03) mg/mL降至(5.42±0.009) mg/mL,催化效率僅降低了0.55%。

圖7 LF-EMF下不同離子強度對α-淀粉酶催化效率的影響

離子對淀粉酶活性的影響機理很復雜,一般認為,無機離子是通過改變酶蛋白的構象來影響酶的活性的[25-27]。由于離子以強帶電顆粒形式存在,其在反應體系中的運動或與酶蛋白相互作用將受到LF-EMF輻射直接影響。推測在低濃度離子下,提高離子強度有利于改善淀粉酶催化構象的形成,該作用在LF-EMF輻射作用下被進一步強化,表現為最適離子強度的降低及對酶催化活性的促進作用。在高離子強度下,此時無機離子濃度已經滿足酶蛋白最適構型所需,過高的離子濃度反而會對酶活性中心產生遮蔽或阻礙作用,造成對酶催化的抑制作用[28]。在LF-EMF輻射條件下,無機離子運動被加強,其對酶活性中心的遮蔽或阻礙作用被減弱,表現為降低高離子強度對α-淀粉酶的抑制作用。

2.5 LF-EMF對傳質的影響

實驗以溶液中NaCl擴散為模型,探討了LF-EMF對溶液中物質傳質的影響。如圖8所示:隨NaCl的擴散,溶液電導率呈線性上升,LF-EMF輻射處理及對照的電導率時間曲線斜率分別為121.75及98.78,表明LF-EMF輻射處理強化了溶液中離子的擴散,增強因子β=1.23(斜率比)。武宏等[29]曾報道電磁場能夠加速質量傳遞和擴散速率,改善動力學條件,肖祖峰等[10]認為電磁場可以降低傳質過程中的活化能,強化傳質。

圖8 溶液的時間電導率曲線

圖9 表觀膜厚度分析圖

3 結論

LF-EMF輻射可提高α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的反應效率,在反應時間為10 h時,反應效率提高15.90%。LF-EMF對玉米淀粉的形貌及結晶度沒有影響,也未引起α-淀粉酶的一級的變化,因此LF-EMF輻射對提高α-淀粉酶水解玉米淀粉的促進作用并非由于改變底物結構或改變催化劑一級結構所致。實驗雖未直接檢測出LF-EMF輻射對α-淀粉酶圓二色光譜及熒光光譜的影響,但LF-EMF輻射降低了α-淀粉酶最適離子強度,強化了低離子強度條件下無機離子對酶活的促進作用,降低了高離子強度對α-淀粉酶的抑制作用等結果,均表明不能排除LF-EMF輻射影響α-淀粉酶高級構象,進而提高酶促反應效率的可能性。LF-EMF輻射可促進反應過程傳質,是提高α-淀粉酶酶促反應效率的原因之一。在后續工作中,需要進一步研究LF-EMF輻射促進酶催化淀粉水解的反應機理,特別是在應用更有效的技術手段分析LF-EMF輻射對酶高級構象的可能影響,以及LF-EMF輻射對α-淀粉酶在淀粉粒表面吸附作用的影響等方面進行深入的研究。