寒地黑土中產γ-氨基丁酸乳酸菌篩選及發酵培養基優化

劉曉飛,宋 潔,鄭志輝,王 薇,袁海峰,關樺楠,張 娜

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid,GABA)是廣泛存在于動物[1-2],植物[3]和微生物[4]中的非蛋白質氨基酸,具有減少焦慮、增強免疫力[5],降血壓和預防糖尿病[6]等多種生理功能。γ-氨基丁酸主要通過谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)的脫羧作用合成[7],可采用植物富集,化學合成和微生物發酵等方法制備[8],其中,微生物發酵生產GABA是一種更安全的方法[9]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)被認為是一種有價值的益生菌,是最適合發酵生產GABA的食品級微生物[9-10]。目前,產GABA乳酸菌的研究已得到科學工作者的廣泛關注,梁金鐘等[11]在酸菜液中分離出的乳酸菌,GABA的含量可達到102.37 μmol/L;韓雪等[12]從酸菜汁中分離出GABA產率為2.16 g/L的植物乳桿菌;有研究[13]表明:從黃漿水中篩出的植物乳桿菌,產GABA的能力較好。

寒地黑土是指北溫帶的黑吉遼和內蒙古黑土區,具有深厚腐殖質層的高寒黑色土壤,是菌種篩選的特殊資源。徐冬云等[14]從土壤、泡菜、酸奶等樣品中篩選出GABA含量達0.463 g/L的6#菌株,并對其進行了初步的鑒定。但是國內尚無對于從寒地黑土資源中篩選產GABA乳酸菌的報道。本研究選取牡丹江、漠河、五常的寒地黑土進行產GABA乳酸菌的篩選,對所篩選的乳酸菌進行形態學觀察、生理生化鑒定及其產GABA能力的評價,并對其發酵培養基進行了優化,旨在為獲得高產GABA的優勢菌種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 采自黑龍江省五常,漠河和牡丹江的寒地黑土,距離地表1～2 cm深,過2 mm篩備用;GABA 美國Sigma公司;L-谷氨酸、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、牛肉粉、無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨 分析純,天津市大茂化學試劑有限公司;細菌微量生化鑒定管 上海谷研實業有限公司;水為蒸餾水。

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SHB-IV分光光度儀 鄭州長城科工貿有限公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海申安醫療器械廠;DHP-9162電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;BS-224-S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;H1650-W高速臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 液體MRS培養基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,牛肉粉10 g/L,無水乙酸鈉5 g/L,檸檬酸氫二銨2 g/L,葡萄糖10 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,MnSO40.25 g/L,K2HPO42 g/L,1 mL吐溫-80,pH6.2,121 ℃,滅菌30 min。

固體培養基:液體MRS培養基基礎上,加1.5%的瓊脂,121 ℃,滅菌30 min。

TYG發酵培養基:胰蛋白胨5 g/L,葡萄糖10 g/L,酵母粉2 g/L,丁二酸鈉5 g/L,L-MSG 10 g/L,pH6.8,121 ℃,滅菌30 min。

1.2.2 菌株的分離、純化及保存 稱取1.0 g土壤樣品,放入250 mL錐形瓶中并加入100 mL無菌水,搖床振蕩30 min,取上清液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個濃度梯度。取200 μL涂布于MRS固體培養基(含0.01%放線菌酮)上,37 ℃條件下培養48 h后,挑取不同形態的菌落,并在MRS固體培養基上反復劃線純化。選取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性的菌株進行顯微觀察、編號、記錄菌落形態并傳代。收集菌泥、加入30%甘油保護劑,并于-80 ℃超低溫冰箱中儲存[12]。

1.2.3 菌株的形態學觀察及生理生化鑒定 觀察MRS固體培養基上菌落的大小、顏色、邊緣情況、革蘭氏染色后的個體形態,然后對篩選得到的 5 株菌株進行各種生理生化鑒定[15],包括接觸酶實驗、吲哚乙酸實驗、硫化氫實驗、石蕊牛奶實驗、明膠液化實驗、檸檬酸鹽實驗、糖發酵實驗[16-17]。最后根據生理生化鑒定的結果查第8版《伯杰細菌鑒定手冊》鑒定菌株的種屬[18]。

1.2.4 菌株產GABA能力的測定

1.2.4.1 產GABA乳酸菌的發酵 參照文獻[19]進行菌懸液的制備,然后在TYG液體培養基(含有1%谷氨酸)中以1%接種量接種篩選得到的乳酸菌菌株,37 ℃靜置培養48 h,取上述菌株的發酵液3 mL,沸水浴5 min后離心5 min(9980 r/min),取上清液并4 ℃保存以進行定性和定量實驗[12]。

1.2.4.2 GABA的定性檢測 取 1.2.4.1 中發酵液的上清液進行薄層層析實驗,利用正丁醇∶冰醋酸∶水=12∶3∶5作展開劑,0.4%的茚三酮溶液作顯色劑進行菌株的定性檢測,與GABA標準品的Rf值進行比較(Rf:原點到斑點中心的距離與原點到溶劑前沿距離的比值)[20]。

1.2.4.3 GABA的定量檢測 取 1.2.4.1中發酵液的上清液進行定量檢測。上清液稀釋15倍,移取0.4 mL稀釋的發酵液,然后根據Berthelot改良比色法測定菌株GABA產量,具體步驟詳見文獻[13]。

1.2.5 TYG發酵培養基優化的單因素實驗 以發酵產生的GABA含量為指標,研究碳源種類(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸鈉)、氮源種類(硫酸銨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、牛肉粉)、碳氮比(5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)、初始pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)和 L-谷氨酸濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)對GABA產量的影響,且后續因素的實驗均在前一因素實驗的較優結果上進行[21]。

1.2.5.1 碳源種類的篩選 分別向不同的錐形瓶中加入胰蛋白胨、酵母粉，1%的L-谷氨酸，再以1∶1的碳氮比加入不同的碳源(麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、丁二酸鈉、可溶性淀粉)，調整培養基的初始pH為6.8，然后測定不同碳源對GABA產量的影響。

1.2.5.2 氮源種類的篩選 分別向不同的錐形瓶中加入葡萄糖，1%的L-谷氨酸，再以1∶1的碳氮比加入不同的氮源(硫酸銨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、牛肉粉)，調整培養基的初始pH為6.8，然后測定不同氮源對GABA產量的影響。

1.2.5.3 碳氮比對GAGA產量的影響 分別向不同的錐形瓶中加入葡萄糖，1%的L-谷氨酸，再以不同的碳氮比(5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)加入硫酸銨，調整培養基的初始pH為6.8，然后測定不同碳氮比對GABA產量的影響。

1.2.5.4 初始pH對GAGA產量的影響 分別向不同的錐形瓶中加入葡萄糖，1%的L-谷氨酸，再以1∶1的碳氮比加入硫酸銨，調整不同的培養基初始pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)，然后測定不同的培養基初始pH對GABA產量的影響。

1.2.5.5 L-谷氨酸濃度對GAGA產量的影響 分別向不同的錐形瓶中加入葡萄糖，然后以1∶1的碳氮比加入硫酸銨，再向其中加入不同濃度的L-谷氨酸(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)，調整培養基的初始pH為5.5，然后測定不同的L-谷氨酸濃度對GABA產量的影響。

1.3 數據處理

采用Origin 8.6軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株形態學觀察

經過分離純化從寒地黑土中篩選得到24株疑似乳酸細菌的菌落,其中有5株菌株在接觸酶實驗中不產氣泡,為陰性。革蘭氏染色呈紫色,為陽性菌株。 編號為SbO001、SbO002、SbO003、SbO004、SbO005。

在MRS固體培養基上篩選的5株細菌的菌落是圓形的,并且在中央隆起具有光滑細密的表面,具有整齊的邊緣,顏色為乳白色。可以初步推測5株菌株與乳酸菌的菌落特征大致一致。

10×40倍顯微鏡下觀察SbO001、SbO002、SbO003、SbO004、SbO005的革蘭氏染色情況,結果如圖1所示。

圖1 菌株形態學觀察結果Fig.1 Morphological observations of strains

2.2 菌株的生理生化鑒定

菌株SbO001、SbO002、SbO003、SbO004、SbO005的接觸酶實驗、石蕊牛奶實驗、吲哚乙酸實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗和檸檬酸鹽實驗的結果如表1所示。

從表1的實驗結果可以看出,接觸酶實驗不產生氣泡,呈陰性;石蕊牛奶變色并有凝固現象出現,呈陽性;在吲哚實驗中,蛋白胨水培養基中有一個紅色環狀物,證明呈陽性;明膠實驗中,SbO001菌株在4 ℃培養10 min后為液態,呈陽性;其它菌株為固態,呈陰性;硫化氫實驗中,出現黑色,呈陽性;檸檬酸鹽實驗中不變色,呈陰性。

表1 生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results

按生化鑒定管使用說明書進行實驗,將培養好的菌株SbO001、SbO002、SbO003、SbO004和SbO005分別接入15種糖發酵管中,結果見表2。

表2 糖發酵實驗結果Table 2 Sugar fermentation experiment results

從表2的實驗結果可以看出,糖發酵實驗中的SbO001、SbO002、SbO003、SbO004和SbO005菌株不消耗鼠李糖、阿拉伯糖、松三糖和木糖,呈陰性,其他均呈陽性,且接觸酶實驗沒有氣泡,即所篩菌株不產過氧化氫酶,根據《伯杰細菌鑒定手冊》第8版第十四部分革蘭氏陽性球菌,可以將五株菌株初步鑒定為鏈球菌科。

2.3 菌株發酵液中GABA的定性

菌株發酵液中GABA的薄層色譜結果如圖2所示。

圖2 薄層層析結果Fig.2 Result of thin layer chromatography注:樣1:GABA標準品;樣2:L-Glu標準品; 樣3～樣7:SbO001～SbO005。

通過薄層層析定性分析后,結果顯示5株菌株的發酵液都具有與GABA標準品相同的Rf值斑點,初步認為該5株菌為產GABA的菌株,篩選的菌株產L-谷氨酸的能力較強。GABA的具體含量還需要進一步測定。

2.4 菌株發酵液中GABA的定量

2.4.1 Berthelot比色法標準曲線的繪制 參照文獻[22]進行測定,然后以GABA的濃度為橫坐標,640 nm波長下的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

如圖3所示,經Origin 8.6統計分析得出回歸方程為Y=2.226x-0.038,相關系數R2=0.9941。因此,GABA濃度與吸光度的相關性在0～0.6 g/L范圍內較好。按照制作標準曲線的方法,測定菌株發酵液吸光度,之后帶入標準曲線計算其GABA含量。

圖3 GABA標準曲線Fig.3 The standard curve of GABA content

2.4.2 5株菌株的GABA定量 取0.4 mL的發酵液,根據Berthelot改良比色法測定5株菌株的GABA產量。

表3 5株菌株的GABA定量結果Table 3 Quantification of γ-aminobutyric acid in five strains

通過對菌株發酵液的定量分析,確定SbO001菌株具有較好的產生GABA的能力,然后對SbO001菌株進行單因素實驗,分析發酵培養基中碳源、氮源、碳氮比、初始pH和L-谷氨酸濃度這5個單因素對GABA產生的影響。

2.5 發酵培養基優化的單因素實驗結果

2.5.1 不同碳源對GABA產量的影響 從圖4中可以看出,SbO001在相同的發酵條件下,有機碳源發酵產GABA的能力優于無機碳源。在6種碳源中,以葡萄糖為有機碳源的SbO001菌株GABA產量最高,為0.556 g/L,而無機碳源丁二酸鈉利用率較低,為0.146 g/L,以麥芽糖、乳糖、蔗糖為碳源的菌株GABA產量沒有明顯差別,故選擇葡萄糖作為主要碳源進行實驗。

圖4 不同碳源對GABA產量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on GABA production

2.5.2 不同氮源對GABA產量的影響 可以從圖5中看出,SbO001可以較好地利用硫酸銨,當硫酸銨作唯一氮源進行實驗時,GABA的產量最佳,為0.947 g/L,對大豆蛋白胨的利用是最差的,為獲得較高的GABA產量,可以考慮選擇廉價的無機氮源硫酸銨作氮源進行發酵培養。

圖5 不同氮源對GABA產量的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on GABA production

2.5.3 不同碳氮比對GABA產量的影響 從圖6中可以看出,當碳氮比為1∶1時,GABA的產量最高,為0.924 g/L;當碳氮比為5∶1時,GABA的產量最低,為0.788 g/L。因此選擇適宜的碳氮比為1∶1。

圖6 不同碳氮比對GABA產量的影響Fig.6 Effect of different carbon and nitrogen ratios on GABA production

2.5.4 培養基初始pH對GABA產量的影響 圖7顯示,當培養基的初始pH從3.5增加到5.5時,GABA產量也增加,pH從3.5增加到4.5時,GABA產量的增加幅度最大,從4.5增加到5.5的過程中,增幅相對較小,在初始pH=5.5時,獲得GABA的最大產量。隨后在初始pH超過5.5時,GABA的產量隨之減少。高或低的pH可能導致一些GAD活性損失[23],從而會對GABA的產量造成抑制作用,這表明初始pH為5.5時更有利于GABA產生。

圖7 不同初始pH對GABA產量的影響Fig.7 Effect of different initial pH on GABA production

2.5.5 不同底物濃度對GABA產量的影響 由圖8可知,當L-谷氨酸濃度在0.5%～1.0%時,GABA的產量隨著L-谷氨酸濃度的增加而增加。當L-谷氨酸濃度在1.0%～3.0%時,隨著L-谷氨酸濃度的增加,GABA的產量逐漸下降。很明顯,過高濃度的L-谷氨酸會抑制GABA的產生,這可能是由于菌體內的谷氨酸脫羧酶不足,產生了底物抑制[24]。Haixing Li等[25]的研究也表明,L-谷氨酸的濃度過高對菌株的生長有害,所以最佳產GABA的L-谷氨酸濃度是1.0%。

圖8 不同L-谷氨酸濃度對GABA產量的影響Fig.8 Effect of different L-glutamic acid concentrations on GABA yield

當發酵培養基組分碳源為葡萄糖,氮源為硫酸銨,碳氮比1∶1,初始pH為5.5,底物為1.0%的L-谷氨酸時,菌株產GABA的能力較好,為 1.112 g/L。

3 結論

GABA作為一種新的與健康相關的生物活性物質是一個研究熱點[24]。本研究從寒地黑土中篩選產GABA的乳酸菌菌株,結果表明:共篩出五株菌株,初步鑒定為鏈球菌科。通過定量實驗發現:來自牡丹江的乳酸菌菌株SbO001的GABA產量最高,為0.81 g/L,具有良好的GABA生產活性。在進行發酵培養基優化實驗后發現:當發酵培養基組分碳源為葡萄糖,氮源為硫酸銨,碳氮比1∶1,初始pH為5.5,底物為1.0%的L-谷氨酸時,菌株產GABA的能力較好,為 1.112 g/L。篩選的菌株產L-谷氨酸的能力較強,而L-谷氨酸經谷氨酸脫羧酶脫羧后可以得到GABA,是一株高產GABA的潛在菌株。寒地黑土是菌種篩選的新來源,目前所篩選菌產GABA的含量不高,但是可以通過誘變[26]、基因工程菌改造[27]等手段來提升所篩選的菌株產GABA的能力,課題組未來的工作將致力于這方面研究。