結(jié)直腸癌組織中MMR蛋白表達(dá)缺失的影響因素分析

郭源 張龍 張舜 余彥平 呂勇志 李紀(jì)鵬

結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展過程復(fù)雜，涉及多個基因的參與[1]。錯配修復(fù)（MMR）基因突變導(dǎo)致的MMR缺陷是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[2-3]。研究表明，MMR蛋白表達(dá)與腫瘤病理及患者預(yù)后相關(guān)[4-5]。2017版美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南建議，對所有結(jié)直腸癌患者進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）/MMR檢測[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)與人類有關(guān)的MMR有9種，其中與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的MMR有4種，即MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2[7]。本文對結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)情況及影響MMR表達(dá)缺失的因素進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年1月至2017年12月在中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的1 560例結(jié)直腸癌患者為研究對象，其中男913 例，女 647 例；年齡 12～92（59.55±13.52）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床病理資料完整；（2）術(shù)前未接受過放化療或其他治療；（3）無其他腫瘤。所有患者簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色 使用全自動免疫組化染色儀（BOND-MAX，美國Leica公司）；檢測試劑主要有MLH1單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號ES05、MSH2單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MX061、MSH6單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MX056、PMS2單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MOR4G，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。取術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織樣本，10%甲醛溶液固定，常規(guī)連續(xù)切片，厚度4μm，脫蠟至水。PBS沖洗，依地酸鈉鈣（EDTA）高壓熱修復(fù)2min，室溫下自然冷卻20min，流水沖洗干凈。PBS沖洗5min×3次，置于3%雙氧水浸泡10min，蒸餾水沖洗干凈。PBS沖洗5min×3次，滴加一抗，連孵育盒放入37℃暖箱孵育1h。PBS沖洗5min×3次，滴加二抗，連孵育盒放入37℃暖箱孵育30min。PBS沖洗5min×3次，DAB顯色劑顯色，PBS終止顯色，流水沖洗1min。蘇木素進(jìn)行復(fù)染，鹽酸乙醇用于分化，乙醇及二甲苯分別用于脫水、透明，封片，鏡檢。陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞膜、細(xì)胞間質(zhì)均不著色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，影響直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的單因素分析采用χ2檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)情況 1 560例結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失315例（20.2%）。其中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 單獨(dú)缺失分別 3、8、17、106例；MLH1 聯(lián)合 PMS2、MSH2 聯(lián)合 PMS2、MSH2 聯(lián)合MSH6、MSH6聯(lián)合 PMS2缺失分別 97例、1例、67例、8例；MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失 4 例，MLH1、MSH6、PMS2 共同缺失 3 例；MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失1例。

2.2 影響結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的單因素分析 結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失與患者性別、腫瘤部位、腫瘤類型、T分期均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與患者年齡、腫瘤直徑、分化程度、N分期、M分期、TNM分期均有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 1。

表1 影響結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的單因素分析[例（%）]

2.3 影響結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的多因素分析 以MMR表達(dá)缺失為應(yīng)變量，以單因素分析結(jié)果P＜0.05的因素為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤直徑、分化程度（低分化）是結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的獨(dú)立影響因素，見表2。

表2 影響結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的多因素分析

3 討論

在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，其病死率居所有惡性腫瘤的第4位，嚴(yán)重威脅著人類健康[8]。導(dǎo)致結(jié)直腸癌的外在不良因素主要有高脂、低纖維飲食等[9]。同時，其內(nèi)在因素也不能忽視。繼1993年首次發(fā)現(xiàn)MMR基因以來，越來越多學(xué)者探索其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系。在正常機(jī)體內(nèi)，存在著一套完整的修復(fù)系統(tǒng)，對維護(hù)基因的穩(wěn)定性和完整性起著重要作用，如MMR系統(tǒng)等[10]。MMR系統(tǒng)能特異性地發(fā)現(xiàn)并矯正DNA堿基的錯配，避免基因發(fā)生突變，防止腫瘤的發(fā)生[11-12]。當(dāng)MMR基因受到外界因素（如生物因素、溫度變化等）的干擾會發(fā)生突變，不能識別DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯配，從而導(dǎo)致MSI的發(fā)生[13]。

目前對MMR基因的檢測方法主要有DNA測序法、免疫組化法。DNA測序法采用美國國立癌癥研究所推薦的一組微衛(wèi)星標(biāo)記點(diǎn)，即BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；當(dāng)2個及以上分子標(biāo)記顯示異常為高頻MSI，僅1個顯示異常為低頻MSI，無異常為微衛(wèi)星穩(wěn)定[14]。免疫組化法則是通過檢測MMR蛋白表達(dá)進(jìn)行篩查。相比于DNA測序法，免疫組化法操作方便、價格實(shí)惠，被廣泛用于臨床[15]。

相關(guān)研究表明，MMR缺陷會影響腫瘤的生物學(xué)特征，如好發(fā)于右半結(jié)腸、傾向于低分化和黏液腺癌、較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[16-18]。同時檢測MMR蛋白表達(dá)，有利于為結(jié)直腸癌患者術(shù)后診療方案的制定及預(yù)后判斷提供參考[19-21]。有文獻(xiàn)報道，MMR正常的結(jié)直腸癌患者對程序性死亡受體單抗治療無效[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中MMR蛋白表達(dá)缺失率為20.2%，腫瘤直徑、分化程度是結(jié)直腸癌組織中MMR表達(dá)缺失的獨(dú)立影響因素。可見，部分結(jié)直腸癌患者中可出現(xiàn)MMR缺陷，且與腫瘤直徑、分化程度等存在一定的關(guān)系。檢測結(jié)直腸癌組織中MMR蛋白表達(dá)，有助于術(shù)后診療方案的制定與預(yù)后判斷，提高結(jié)直腸癌的診療水平。