基于主成分分析與聚類分析綜合評價不同菌種發酵刺梨果渣的香氣品質

陳思奇，孟 滿，杜勃峰，肖仕蕓，丁筑紅*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實，刺梨富含維生素C、黃酮、多糖、多種人體必需氨基酸和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種營養物質[1]。目前刺梨資源開發中占鮮果40%～50%的果渣綜合利用率低，浪費嚴重[2]。果渣資源化利用的生物發酵技術已有研究報道，主要集中在提高與改善膳食纖維[3-4]，合成營養素[5-6]，生產飼料等方面[7-8]。前期研究發現，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210、生香酵母（aroma-producing yeast）和醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67能夠明顯改善發酵刺梨果渣膳食纖維理化特性[9]，提高其功能活性，但對其食用品質，特別是風味變化及香氣特征缺乏研究。

目前揮發性物質分析鑒定和分類研究可采用感官評價、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）等方法[10]，感官評價存在著極大的主觀因素，采用主成分和聚類分析在揮發性成分含量與香氣描述語等數據的處理中可得到較好的實驗結果[10-13]。本實驗在頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術檢測基礎上，采用SPSS軟件對檢出的香氣成分進行主成分分析和聚類分析，構建刺梨果渣的香氣品質評價模型，獲得不同菌種發酵刺梨果渣風味品質的綜合得分及其分布，以感官評價法驗證，旨在找到一種更加客觀的綜合評價方法，為刺梨果渣產品開發加工和提高綜合利用度提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

刺梨：品種為貴農5號，采摘于貴州龍里縣，充分成熟，挑選新鮮無霉爛變質，冷凍保藏（-10℃），將刺梨榨汁后取果渣（出汁率50%）備用。

菌種：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210：購于貴州輕化工中心；醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67：廣東省微生物菌種保藏中心；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、吐溫-80、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（七水）、硫酸錳（七水）均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸鈉0.05 g，吐溫-80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，碳酸鈣20.0 g，瓊脂（1.5 g/100 mL），蒸餾水1000 mL，自然pH，121℃，0.1 MPa滅菌30 min，37℃靜置培養24～48 h，用于乳酸菌擴大及斜面菌種培養。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C GC/MS聯用儀：美國安捷倫公司；SPX-150BⅢ型電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LS-50HG立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；JYZ-E6T型九陽榨汁機：九陽股份有限公司；XMTD-204數顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；57304-手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵菌種的培養

醋酸桿菌活化：葡萄糖10.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸鈣15.0 g，無水酒精20.0 mL，瓊脂20.0g，蒸餾水1 000 mL，不調pH，無水酒精在培養基滅菌后冷卻至50～60℃加入，冷卻至室溫接種醋酸桿菌，置于30℃靜置培養24～48 h備用。

酵母菌活化參照文獻[14]進行改進如下：在酵母菌粉中按質量比1∶20加入35～40℃的溫水，使其均勻分散，加入5%的蔗糖，活化20～30 min。待菌液降至室溫接種酵母菌。

乳酸菌活化[9]：MRS活化培養液121 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻至室溫分別接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210的保藏培養物，37℃靜置培養24～48 h備用。

1.3.2 不同菌種發酵刺梨果渣

500 mL三角瓶中添加50 g刺梨果渣，按料液比1∶5（g∶mL）加入蒸餾水，用棉塞塞緊瓶口，煮沸滅菌10 min，待其冷卻后于無菌操作臺分別以接種量10%接入上述活化醋酸菌、酵母菌、乳酸菌擴大培養的種子液（106～107CFU/mL），在自然pH條件下，將發酵液分別以發酵溫度28℃、30℃、37℃條件下發酵48 h后進行GC-MS檢測。

1.3.3 刺梨果渣香氣SPME-GC-MS檢測

固相微萃取條件：取15 g發酵果渣，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在85℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進樣。

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫42℃（保留2 min），以4℃/min升溫至280℃，保持2 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間：1.5 min。

MS條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6μA；倍增器電壓1 425 V；接口溫度280℃；質量范圍20～450 amu。

定性定量分析：對總離子流圖中各峰經質譜計算機數據系統檢索、人工解析圖譜及與美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）2008和Wiley275質譜庫匹配，確認香氣成分的各化學組成，只有當正反匹配度均＞800（最大值1 000）的鑒定結果才予以確認，用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量。

1.3.4 刺梨果渣香氣感官評定

感官評分采用9點標度法[15]。由10位經過一定訓練的評價人員（相關專業的老師和學生共10名）組成的評分小組按感官評分標準對不同菌種發酵刺梨果渣香氣進行加權評分，將其平均分作為最終得分，權重及感官評分標準見表1。

表1 發酵刺梨果渣感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermented Rosa roxburghii pomace

1.3.5 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 23.0對刺梨果渣揮發性物質進行PCA和CA分析，Excel2016制作模型得分圖。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發酵的刺梨果渣香氣成分種類及相對含量

采用HS-SPME-GC-MS技術對刺梨果渣的香氣成分進行檢測，得到不同菌種發酵的刺梨果渣香氣成分種類以及相對含量，結果分別見表2、表3。

表2 不同菌種發酵刺梨果渣的GC-MS分析結果Table 2 Analysis results of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains by GC-MS

續表

續表

表3 不同菌種發酵刺梨果渣香氣成分種類及相對含量Table 3 Species and relative contents of aroma components of Rosa roxb urghii pomace fermented by different strains

由表2和表3可知，刺梨原果渣與不同菌種發酵的果渣共檢測鑒別出110種香氣成分，其中對照組原果渣檢出79種，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208組分別檢出56種、62種、55種、65種。共同檢出的風味物質為烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類和其他等7類化合物。其中5種果渣中烴類物質數量及含量明顯高于其他種類物質，相對含量為49.184%～58.036%。烴類一般香氣閾值較高，除了可延長發酵果渣香氣留香時間外，香氣直接貢獻不大[16-18]。醇類物質是微生物通過氨基酸代謝產生[19]，主要呈現清香和青鮮香氣[20]，是刺梨果渣香氣成分的重要組成部分，相對含量為3.494%～12.598%。GIM.1.67與CICC.22210發酵果渣后都產生了新成分橙花醇，呈玫瑰花香；異戊醇是酵母發酵的產物，賦予果渣愉快的果香和花香[21]；苯乙醇也為酵母發酵的特有產物[22]，其本身具有花香、甜、清香和玫瑰香氣，除本身愉快的風味外，還可作為其他易揮發風味物質的溶劑[23]，對發酵果渣的風味具有雙重影響功能。酯類物質相對含量為0.226%～11.285%，酵母菌組酯類物質的種類與含量相對更加豐富，可能因為該生香酵母菌發酵具有很強的產香能力，尤以產酯香為主的香味物質最多[24]。酯類物質大多具有不同水果香氣[25-27]，閾值一般較低，是刺梨果渣整體香氣形成的重要組成部分。酸類物質的相對含量為2.511%～22.152%，對照組及處理組發酵后均檢出辛酸，可以作為酯類物質的前體物質[23]，對果渣風味起到間接作用。GIM.1.208和CICC.22210組酸類相對含量較高，酸澀氣味強烈，可能與其較高含量的揮發性脂肪酸類物質辛酸有關[28]。醛酮類物質也是刺梨及發酵產物特征香氣的重要揮發性成分[29]，高濃度的醛類物質會帶來異味[30]，且醛類物質不穩定，在微生物作用下被還原為醇或被氧化為酸[31]，可能是發酵后的刺梨果渣較原果渣相比，醛類相對含量減少，醇類、酸類相對含量增多的原因之一。

從整體上看，不同樣品的香氣成分構成及含量差異較大，表明不同處理組之間風味特征及風味品質具有差異性，進而采用PCA和CA的方法對刺梨果渣進行綜合評價與品質區分，便于對后期菌種的篩選與相關果渣產品的加工生產的指導。

2.2 不同菌種發酵刺梨果渣香氣成分主成分分析

2.2.1 主成分分析結果

將表3數據標準化，以各樣品組檢測出的香氣成分種類的相對含量矩陣為指標，用SPSS進行主成分分析，得到主成分特征根及特征向量，以風味物質貢獻率97%以上為標準，確定主成分個數及每個主成分所反映的因子，結果見表4和表5。

表4 提取3個主成分的特征值以及方差貢獻率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of extracted three principal components

由表4可知，取特征值＞1的成分為主成分，得到3個主成分，且這3個主成分的方差累計貢獻率達到97.367%，表示能夠解釋刺梨果渣香氣大部分的成分信息，因此，選擇這3個主成分進行風味品質分析。

表5 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 5 Eigenvector and loading matrix of principal components

圖1 不同菌種發酵刺梨果渣香氣成分主成分分析載荷圖Fig.1 Principal component analysis load diagram of aroma components of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表4、表5結合圖1可以看出，第1主成分的方差貢獻率為44.073%，主要反映醇類、酯類這2種香氣成分的變異信息，且第1主成分與兩者呈正相關；第2主成分的方差貢獻率為33.679%，主要反映酸類、醛類這2種香氣成分的變異信息，與酸類呈負相關，與醛類呈正相關；第3主成分的方差貢獻率為17.615%，主要反映烴類、酮類的變異信息，與烴類呈負相關，與酮類呈正相關。由于PC1能夠概括大部分香氣成分信息，影響其化合物可作為主要風味化合物。因此，醇類和酯類是不同菌種發酵刺梨果渣的香氣差異化的的主要影響因素。

2.2.2 基于主成分分析建立香氣品質評價模型

根據表4和表5，以3個主成分代表原來7種風味成分所表達的信息，建立不同樣品風味品質的評價模型，得出以下刺梨果渣風味成分的線性關系式，式中X1～X7為不同物質種類相對含量標準化后的值，Y1、Y2和Y3表示3個主成分的得分分值，分值越大，表示果渣風味品質越好。

將表5的特征向量進行標準化處理，與所對應的3個主成分旋轉之前的方差貢獻率做內積，得到綜合風味品質的評價函數Y的表達式為Y=0.440 73Y1+0.336 79Y2+0.176 15Y3，得到的風味評價綜合得分值及排序見表6。

表6 標準化后主成分綜合得分Table 6 Comprehensive score of principal components after standardization

由表6可知，第1主成分得分最高的為酵母菌組，其次為GIM.1.67組，第2主成分得分最高的為GIM.1.67組，第3主成分得分最高的為對照原果渣組。綜合評價，菌株GIM.1.67發酵的刺梨果渣得分最高，為0.933分，其次為酵母菌組、原果渣組、CICC.22210組、GIM.1.208組。

2.3 不同菌種發酵刺梨果渣香氣成分聚類分析

采用聚類分析以評估各樣品香氣成分的變化，具有最大相似度的樣品被優先聚類，通過SPSS23.0軟件，以類間平均距離法為測量方法，以Euclidean距離作為度量標準，將5種刺梨果渣樣品的香氣成分聚類成樹狀圖見圖2。

圖2 聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram for cluster analysis

由圖2可知，當Euclidean距離等于5時，CICC.22210組與GIM.1208組被聚為一類，說明這2種菌種發酵刺梨果渣后整體風味輪廓相似。當Euclidean距離增加到25時，GIM.1.67組才與其他組樣品聚為一類，說明GIM.1.67組與其他樣品之間相似度較低，整體風味輪廓不同。刺梨原果渣與發酵之后的果渣風味輪廓具有差異性，表明了經過不同菌種發酵后，刺梨果渣風味改變顯著，CA結果與PCA結果相一致。

2.4 不同菌種發酵刺梨果渣感官評價分析

通過感官評價可以進一步驗證與所建立的香氣模型是否具有一致性[32]。本實驗按感官評分標準（見表1）對不同菌種發酵刺梨果渣香氣進行加權評分，將其平均分作為最終得分，與模型評價結果進行驗證，感官評價結果見表7。

表7 不同菌種發酵刺梨果渣香氣感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of aroma in Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表7可知，感官評分由大到小依次為GIM.1.67組、酵母菌組、原果渣組、CICC.22210組、GIM.1.208組，通過GIM.1.67發酵后刺梨果渣被賦予了濃厚的發酵香氣，且刺梨香濃郁，獲得了比原果渣更加協調的香氣。通過對比所建立的香氣品質評價模型得分，兩者具有較好的一致性。由此可見，基于主成分分析法初步構建的香氣品質綜合評價模型具有可靠性及適用性。

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS鑒別不同菌種發酵刺梨果渣的香氣成分。刺梨原果渣與4種不同菌種發酵的果渣總共檢測鑒別出110種香氣成分，包括烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類和其他類化合物。其中刺梨原果渣檢出79種，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208發酵后分別檢出56種、62種、55種、65種。通過主成分分析，醇類和酯類是影響不同菌種發酵刺梨果渣的香氣的主要因素。利用主成分分析建立風味品質綜合評價模型，可以計算出GIM.1.67發酵的刺梨果渣得分最高，為0.933分，其次為酵母菌發酵、原果渣、CICC.22210發酵、GIM.1.208發酵。通過感官法評價驗證，對比所建立的香氣品質評價模型得分，兩者具有較好的一致性。通過聚類分析，當Euclidean距離等于5時，CICC.22210發酵與GIM.1208發酵被聚為一類，說明2種菌種發酵刺梨果渣后整體風味輪廓相似。刺梨原果渣與發酵之后的果渣風味輪廓具有一定差異性，表明了經過不同菌種發酵后，刺梨果渣風味改變顯著。由此可見主成分分析法與聚類分析法能較好地反映刺梨果渣樣品的差異性。