濃香型白酒對(duì)急性酒精中毒小鼠宿醉頭痛指標(biāo)的影響

胡力文，楊 飛，趙婉妤，許 欣*，裴曉方，盧中明，杜禮泉，鄭 敏

（1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川省綿陽(yáng)市豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 綿陽(yáng) 621006）

中國(guó)酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，酒在當(dāng)今社會(huì)的各種交際活動(dòng)、社交場(chǎng)合更是不可或缺。但近年來(lái)研究顯示，國(guó)內(nèi)外急性酒精中毒發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)，考慮其龐大群體，并且容易成為多種急癥的誘發(fā)因素，故應(yīng)予以重視[1]。急性酒精中毒是指在短時(shí)間內(nèi)攝入大量酒精或含酒精飲料后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂狀態(tài)，嚴(yán)重程度與飲酒速度、飲酒量、血液酒精濃度及個(gè)體耐受性等有關(guān)，通常伴有頭痛、頭暈和胃部不適等延續(xù)效應(yīng)[1-2]。

宿醉頭痛或是酒精誘導(dǎo)的遲發(fā)性頭痛通常在飲酒結(jié)束后的4～24 h內(nèi)發(fā)生，出現(xiàn)與偏頭痛發(fā)病類似的癥狀（如畏光、單側(cè)頭痛等[3]）。關(guān)于頭痛的機(jī)制眾說(shuō)紛紜，目前占據(jù)主導(dǎo)地位的是三叉神經(jīng)血管說(shuō)，學(xué)者們認(rèn)為當(dāng)三叉神經(jīng)末梢受刺激時(shí)，會(huì)引起顱內(nèi)腦外血管擴(kuò)張，使環(huán)繞血管周圍的三叉神經(jīng)感覺(jué)C纖維釋放具有強(qiáng)烈血管刺激作用的肽類物質(zhì)，并刺激腦內(nèi)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放具有血管活性、促炎、感覺(jué)敏感介質(zhì)，從而引起頭痛[4-6]。

隨著生活方式的改變，人們對(duì)生活質(zhì)量的要求越來(lái)越高。白酒作為飲品，不僅要求飲時(shí)口感舒適，而且更注重飲后的體征感受；既能滿足對(duì)人精神激活的程度，又不至于影響生活、工作和健康。目前，已有研究表明不同品質(zhì)白酒對(duì)機(jī)體的影響存在差異[7-8]，但鮮見針對(duì)飲酒上頭的相關(guān)研究報(bào)道，故本研究將采用急性酒精中毒小鼠模型，結(jié)合行為學(xué)表現(xiàn)，探討比較不同濃香型白酒對(duì)宿醉頭痛相關(guān)效應(yīng)指標(biāo)的影響，為釀酒工藝的進(jìn)一步改良奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同品牌不同勾調(diào)工藝的48°濃香型白酒（編號(hào)分別為①號(hào)、②號(hào)），主要理化成分見表1，由四川省綿陽(yáng)市豐谷酒業(yè)有限公司提供。

表1 48°濃香型白酒主要理化成分Table 1 Main physical and chemical components in strong-flavor Baijiu with 48%alcohol content

Balb/c小鼠（雄性，日齡（42～48 d），SPF級(jí)）：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限技術(shù)公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011）。獨(dú)立通氣籠盒（individually ventilated cages，IVC）室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～22℃，相對(duì)濕度60%～70%，由四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-011）。

肝素試劑：南京建成生物工程研究所；乙醇（體積分?jǐn)?shù)99.7%，分析純）：成都海興化工試劑廠；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒、組胺（histamine，HIS）酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；小鼠內(nèi)皮素（endothelin，ET）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠P物質(zhì)（substance P，SP）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠甲硫氨酸腦啡肽（methionine enkephalin，MEK）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：上海酶聯(lián)科技生物有限公司；1%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、抑肽酶、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）放射免疫測(cè)定試劑盒：美國(guó)鳳凰生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀、7697A頂空進(jìn)樣器：美國(guó)Agilent公司；ECTM-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm×1.2μm）：美國(guó)Alltech公司；HeraeusTMFrescoTM21微量離心機(jī)、Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Scientific公司；749540-0000手持式勻漿器：美國(guó)Kimble公司；γ放射免疫計(jì)數(shù)器：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；手動(dòng)連續(xù)分液器：美國(guó)Gilson公司；TS-1脫色搖床、XW-80A渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；V型槽：自制。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

160只Balb/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量進(jìn)行分層隨機(jī)分組，分為樣①組、樣②組、酒精對(duì)照組和空白對(duì)照組，劑量設(shè)置見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理情況Table 2 Grouping and processing of experimental animals

1.3.2 翻正反射實(shí)驗(yàn)

禁食不禁水12 h，不同組別小鼠稱體質(zhì)量后，分別按相應(yīng)劑量進(jìn)行灌胃。參考CRABBE JC等方法[9]，將小鼠背部置于V型槽中呈仰位，30 s內(nèi)未能翻轉(zhuǎn)身體，即翻正反射消失，記錄醉酒時(shí)間（min）；60 s內(nèi)能連續(xù)2次翻轉(zhuǎn)身體，即翻正反射恢復(fù)，記為醒酒時(shí)間（min）；并計(jì)算醉酒率（%）。

1.3.3 標(biāo)本采集與處理

當(dāng)小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)，立即抓取固定使其眼球突出充血，用彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，使血液流入抗凝離心管中，顛倒混勻后4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，-20℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。不同的抗凝劑適用于不同的指標(biāo)測(cè)定，加入100μL肝素鈉溶液的抗凝管用于乙醇、PGE2、HIS含量測(cè)定；加入100μL 1%EDTA、100μL抑肽酶的抗凝管用于ET、SP、MEK、CGRP含量測(cè)定。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè)

血漿乙醇濃度測(cè)定：標(biāo)本平衡至室溫后，取200μL待測(cè)標(biāo)本加入頂空玻璃中，再加入2 mL超純水，蓋緊瓶蓋后放于頂空進(jìn)樣裝置中進(jìn)行汽化平衡，自動(dòng)進(jìn)樣1 mL，氣相色譜法檢測(cè)。色譜條件：ECTM-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm×1.2μm）；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；載氣：N2（純度99.999%），流速25 cm/s；氫火焰離子化檢測(cè)器：250℃；進(jìn)樣口溫度：200℃；程序升溫：40℃保留5 min，以20℃/min升至200℃，保留7 min；頂空氣化條件：平衡時(shí)間30 min，加熱溫度70℃，傳輸線溫度90℃，進(jìn)樣針溫度70℃。

血漿PGE2、HIS、ET、SP、MEK濃度測(cè)定：標(biāo)本及酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒平衡至室溫后，取10μL待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)板內(nèi)，再加入40μL樣品稀釋液，輕搖晃動(dòng)后加入100μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃溫育60 min，洗滌后加入顯色劑，37℃避光顯色15 min，最后加入終止液，以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

血漿CGRP濃度測(cè)定：標(biāo)本及放射免疫法檢測(cè)試劑盒平衡至室溫后，取100μL待測(cè)標(biāo)本加入含有特異性兔抗血清的反應(yīng)體系內(nèi)，渦旋振蕩混勻，4℃孵育24 h后加入100μL125I-示蹤溶液，渦旋振蕩混勻后4℃孵育24 h，最后加入100μL羊抗兔IgG血清，室溫孵育90 min，再加入500μL反應(yīng)緩沖液，混勻后4 ℃，3 000 r/min離心20 min，放射性γ-計(jì)數(shù)儀進(jìn)行沉淀放射衰變率檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。方差齊時(shí)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；方差不齊時(shí)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 行為學(xué)指標(biāo)

急性酒精中毒是指一次性過(guò)量飲酒所致的急性中毒，常伴有頭痛、頭暈和胃部不適等延續(xù)效應(yīng)[2]。研究表明，當(dāng)乙醇暴露劑量超過(guò)3.5 g/kg，絕大多數(shù)小鼠均會(huì)出現(xiàn)翻正反射消失的現(xiàn)象[10]，故根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究采用11 mL/kg體質(zhì)量（約4.2 g/kg）的單次灌胃劑量進(jìn)行急性酒精中毒模型建立。不同組別翻正反射實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 翻正反射實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=40）Table 3 Determination results of behavioral indicators by righting reflex test

由表3可知，樣①組醒酒時(shí)間極顯著低于酒精對(duì)照組（P＜0.01）；其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組間醉酒時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本研究顯示樣①組、樣②組醉酒時(shí)間長(zhǎng)于酒精對(duì)照組，而醒酒時(shí)間則短于酒精對(duì)照組，提示酒樣組具有“醉得慢，醒得快”的趨勢(shì)，與張夢(mèng)妍等[11]對(duì)濃香型白酒醉酒度評(píng)價(jià)研究結(jié)果一致。

2.2 乙醇代謝指標(biāo)

飲酒后，乙醇主要在胃腸道被吸收，約90%～98%的乙醇通過(guò)肝臟進(jìn)行代謝，代謝速率與攝入量、酶活性等相關(guān)[12-13]。不同組別血漿乙醇含量檢測(cè)結(jié)果見表4。

由表4可知，樣①組、樣②組和酒精對(duì)照組乙醇含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），由于灌胃劑量相同，故可推測(cè)酒樣①、酒樣②和酒精對(duì)照在機(jī)體內(nèi)的代謝速度相近。除此之外，過(guò)量攝入乙醇后，當(dāng)超過(guò)肝臟代謝負(fù)荷時(shí)，部分乙醇則會(huì)直接穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦部，進(jìn)而直接或間接引起腦部損傷[14]，且暴露劑量與損傷程度呈正相關(guān)關(guān)系。由表4可以看出樣①組、樣②組和酒精對(duì)照組乙醇含量相當(dāng)，提示酒精暴露組可能產(chǎn)生程度相近的腦損傷。

表4 血漿中乙醇含量檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=10）Table 4 Determination results of ethanol content in plasma

2.3 炎性介質(zhì)指標(biāo)

前列腺素參與哺乳動(dòng)物的炎癥反應(yīng)，是一類重要的炎癥因子[16]，PGE2刺激神經(jīng)末梢是造成炎癥組織疼痛的主要原因[16]。不同組別血漿炎性介質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果見表5。

表5 血漿中炎性介質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=10）Table 5 Determination results of inflammatory medium content in plasma

由表5可知，樣①、樣②組PGE2含量高于酒精對(duì)照組、空白對(duì)照組，且樣②組PGE2含量顯著高于酒精對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），提示酒樣具有一定程度的致炎作用，具體可能與酒樣中雜醇油等微量成分有關(guān)。各組間血漿HIS含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)

CGRP是血管周圍神經(jīng)釋放的最主要的血管活性肽類物質(zhì)，是迄今已知最強(qiáng)的血管舒張肽，在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用[17]。不同組別血漿CGRP、ET含量檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 血漿中降鈣素基因相關(guān)肽、內(nèi)皮素含量檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=10）Table 6 Determination results of calcitonin gene related peptide and endothelin content in plasma

本研究發(fā)現(xiàn)不同組別間CGRP含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示宿醉頭痛與偏頭痛機(jī)制可能存在一定的差異。ET是強(qiáng)烈的血管收縮劑，可引起各種血管劇烈收縮，促進(jìn)血管內(nèi)皮收縮因子的釋放，導(dǎo)致組織缺血、缺氧[18]。當(dāng)ET過(guò)量釋放，作用于腦血管，可使局部血管發(fā)生強(qiáng)烈收縮、痙攣[19]。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、酒精對(duì)照組ET含量高于樣①組、樣②組，說(shuō)明酒樣可通過(guò)降低ET含量使局部血管收縮減弱，進(jìn)而減少疼痛感。

研究表明SP由中樞端末梢神經(jīng)釋放，參與痛覺(jué)傳遞，可促進(jìn)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（MEK等）釋放引起鎮(zhèn)痛作用[20]。不同組別血漿MEK、SP含量檢測(cè)結(jié)果見表7。

表7 血漿中甲硫氨酸腦啡肽、P物質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果（x±s，n=10）Table 7 Determination results of MEK and P substance content in plasma

由表7可知，樣①組血漿MEK含量極顯著高于樣②組、酒精對(duì)照組、空白對(duì)照組（P＜0.01）；其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。樣②組血漿SP含量極顯著低于樣①組、酒精對(duì)照組、空白對(duì)照組（P＜0.01）；其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)樣①組SP、MEK含量均高于樣②組，提示樣①組疼痛感較樣②組更嚴(yán)重。田學(xué)梅等[20]提出過(guò)量醛類物質(zhì)、酸酯比例失調(diào)等是飲酒后上頭的主要因素，結(jié)合兩種酒樣的理化分析結(jié)果推斷，可能與酒樣①中含有更高的總酸、乙醛、乙縮醛等微量成分有關(guān)。

3 結(jié)論

綜上所述，不同濃香型白酒對(duì)小鼠宿醉頭痛相關(guān)效應(yīng)指標(biāo)的影響存在差異，其中酒樣①較酒樣②能誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的SP、MEK含量水平，結(jié)合白酒理化成分分析，提示可能與酒樣中較高的總酸、乙醛、乙縮醛等微量成分有關(guān)。