黃芪發酵過程中內生真菌多樣性變化及其發酵液的抑菌作用

劉 超，于春濤*

（滄州醫學高等專科學校，河北 滄州 061001）

黃芪（Astragali radix）是由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根干燥而來，主要功效包括健脾補中、補氣固元、保肝利尿、抗衰老、斂瘡生肌、降血壓、提高機體免疫力、抗菌等[1-3]。內生菌普遍存在于植物體內，但是由于其定植在健康植物組織的內部，不會產生感染等癥狀，因此長期以來被人們忽視[4]。黃芪中存在一定量的內生真菌，發酵過程中可以將黃芪中的大分子物質轉化為具有生理活性的小分子物質，利于人體的吸收[5]。此外，內生真菌在發酵過程中還能夠參與合成與黃芪功能成分相同或者相似的活性物質，從而提高黃芪的生理功能[6]。

目前，已有很多黃芪內生真菌的相關研究。曹丹丹等[7]研究發現，莖直黃芪內生真菌的優勢種屬為細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）和棘豆彎曲牙管蠕孢菌（Undifilum oxytropis），相對含量分別為32.14%、19.05%；劉蓬蓬等[4]以18S rDNA NS1-Fung區域為信息序列通過Illumina MiSeq高通量測序技術對黃芪內生真菌的多樣性進行了分析，結果表明，黃芪內生真菌主要為駝孢銹菌屬（Hemileia）、赤霉菌屬（Gibberella）、糞盤菌屬（Ascobolus）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）和曲霉屬（Aspergillus），其中優勢種群為駝孢銹菌屬和赤霉菌屬。植物通過發酵不僅可以將大分子物質轉化成有利于人體吸收的生物活性小分子物質，也可以提高某些植物的抑菌活性[8-10]。牛明福等[11]研究發現，連翹內生菌發酵液能夠有效的抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）的生長。

本研究首先利用Illumina MiSeq高通量測序技術對不同發酵階段的黃芪內生真菌發酵液進行多樣性分析，揭示內生真菌在黃芪發酵過程中生物多樣性的變化規律。在此基礎上，對得到的黃芪內生真菌發酵液進行抗菌活性分析，并初步揭示其可能的抗菌機理，以期為拓展黃芪內生真菌發酵液的實際應用提供可供參考的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及菌株

黃芪：于2018年5月采自內蒙古包頭市土默特右旗，采集后放入自封袋中，避光保存，利用真空冷凍干燥技術對其進行脫水處理；大腸桿菌（Escherichia coli）O157∶H7、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 49775：美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）。

1.1.2 培養基及主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、LB肉湯培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基：青島海博生物技術有限公司；無水乙醇、戊二醛、丙酮（均為分析純）：德州潤昕實驗儀器有限公司；1%餓酸固定液、醋酸鈾（分析純）、檸檬酸鉛（分析純）：滄州卓亞化工有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速提取試劑盒、核酸純化試劑盒、2×Taq master mix：天根生化科技（北京）有限公司；真菌NS1-Fung通用引物：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

AE523電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；JEOL JEM-2800高通量場發射透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；T100梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 黃芪內生真菌發酵液的制備

取20 g干燥的黃芪，對其進行粉粹處理后，加入100 mL無菌水中，混合均勻，在31℃、150 r/min條件下發酵8 d，得到黃芪內生真菌發酵液[6]。分別取發酵第0、1、3、5、8天的發酵液進行真菌多樣性的研究。

1.3.2 發酵液DNA的提取及PCR擴增

按照真菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書的步驟，提取不同發酵時間條件下黃芪內生真菌發酵液的基因組DNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及純度。以真菌DNA為模板，以NS1（5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和Fung（5′-GACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGTTG-3′）為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件參考劉蓬蓬等[5]的方法步驟。利用核酸純化試劑盒對得到的PCR擴增產物進行純化、回收并測序。

1.3.3 測序及生物信息學分析

樣品DNA的Illumina Miseq高通量測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行。為了得到高質量的序列，對獲得的原始序列進行適當的過濾和拼接，去除低質量的序列，使得最后的數據更準確可靠。利用微生物生態學的定量洞察（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）分析平臺對過濾后的DNA序列進行生物信息學分析，以操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）相似度97%為閾值，對不同發酵階段樣品真菌的豐富度（Chao指數）和多樣性（Shannon指數）進行分析[12-14]。

1.3.4 發酵液抑菌效果的評估

根據PENG F等[15]的研究，利用牛津杯法測定黃芪內生真菌發酵液對E.coli O157∶H7和S.aureus ATCC 49775的抑菌效果，抑菌圈直徑均＞10 mm，被認為有抑菌活性；利用瓊脂稀釋法測定發酵液對受試菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。在此基礎上，取100μL指示菌菌液（菌液濃度為108CFU/mL）于濃度≥1MIC的發酵液中37℃處理1 h，處理后的菌液在TSA平板中，37℃培養24 h，使菌落無法長出的菌體濃度為發酵液的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.5 受試細胞的透視電鏡分析[15-17]

分別用菌體濃度為1 MIC的黃芪內生真菌發酵液處理E.coli O157∶H7和S.aureus ATCC 49775，振蕩混合均勻后，在37℃條件下培養1 h，5 000 r/min離心15 min，得到菌體。加入2.5%戊二醛溶液固定2 h，8 000 r/min離心10 min，棄上清，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液漂洗2次，每次15 min。用1%的餓酸固定液固定40 min。分別用體積分數為50%、70%、90%、100%的乙醇對樣品進行脫水處理，包埋后用體積分數50%乙醇溶液配制成的4%醋酸鈾染色20 min，雙蒸水（ddH2O）沖洗后用檸檬酸鉛染色20 min，采用電鏡儀對制備好的樣品切片進行拍照。

1.3.6 數據分析

實驗均重復3次，利用SPSS20.0軟件對數據進行處理，選擇Tukey′s法檢驗，P＜0.05時，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 測序數據合理性分析

圖1 黃芪內生真菌發酵液稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curves of fermentation liquid of endophytic fungi in Astragali radix

得到樣品真菌序列后，繪制黃芪內生真菌發酵液稀疏曲線，對測序結果進行合理性分析，如圖1所示。由圖1可知，5個樣品的稀疏度均隨著測序序列數的增加而增加，在稀疏曲線的后端稀疏度受測序序列數目的影響越來越小，趨于平緩，這說明再繼續增加測序序列的數目不會對OUT的數量產生顯著的影響，樣品的信息量能夠進行真菌多樣性的分析。

2.2 黃芪內生真菌發酵過程中真菌豐富度和多樣性分析

對5個樣品的序列進行OTUs計算、多樣性及豐富度分析，結果如表1所示。

表1 黃芪內生真菌發酵液的真菌多樣性和豐富度Table 1 Fungal diversity and abundance of fermentation liquid of endophytic fungiin Astragaliradix

由表1可知，5個樣品中的有效序列均為20 158條，5個樣品的Coverage值為0.98～0.99，說明所得到的序列覆蓋了樣品序列的98%以上，可以較為全面的揭示樣品中真菌的多樣性。發酵第0、1、3、5和8天的樣品所對應的OUTs數分別為218±7.36、246±8.45、222±11.86、201±12.02、188±9.33，說明隨著發酵時間的增加，樣品中OTUs的數量先增加后減少。

Shannon指數和Chao指數分別用于衡量環境中微生物的多樣性和豐富度，其中多樣性越高，說明環境中微生物的種類越多；豐富度越高，表明環境中微生物的數量越多[18]。如表1所示，隨著發酵的進行，Shannon指數和Chao指數逐漸減小（P＜0.05），說明在整個發酵過程中真菌的種類和數量都呈現減少的趨勢。

2.3 黃芪內生真菌發酵過程中真菌種群結構分析

利用Illumina Miseq高通量技術分析黃芪發酵過程中內生真菌種群結構的變化情況，結果如圖2所示。由圖2可知，在5個樣品中，相對含量＞0.01%的真菌包含12個屬，分別為駝孢銹菌屬（Hemileia）、赤霉菌屬（Gibberella）、糞盤菌屬（Ascobolus）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、附毛菌屬（Trichaptum）、細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、未分類的（unclassified）、瘋草內生真菌（Undifilum oxytropis）、Stagonosporosis cucurbiraceareum、派倫霉屬（Peyronellaea pinnodella）、Leposphaerulina trifolii、鐮刀真菌（Fusarium torulosum）。隨著發酵時間的延長，發酵液中真菌的種群結構發生了顯著的變化，未發酵的樣品的優勢菌屬為駝孢銹菌屬和赤霉菌屬，在發酵過程中，這兩種真菌逐漸減少，發酵8 d后，優勢菌屬為細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）和瘋草內生真菌（Undifilum oxytropis）。說明在黃芪發酵過程中，內生真菌的種群結構會發生變化，可能是發酵液的環境更適合細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）和瘋草內生真菌（Undifilum oxytropis）的生長繁殖。

圖2 不同發酵時間黃芪內生真菌發酵液中真菌群落結構分析Fig.2 Fungal community structures ananlysis of fermentation liquid of endophytic fungiin Astragaliradix at different fermentation time

2.4 黃芪內生真菌發酵液抑菌效果評估

通過測定黃芪內生真菌發酵液對E.coli O157∶H7和S.aureus ATCC 49775的抑菌圈、MIC和MBC值，評估不同發酵液樣品的抑菌能力，結果如表2所示。

表2 不同發酵時間黃芪內生真菌發酵液的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of fermentation liquid of endophytic fungiin Astragali radix at different fermentation time

由表2可知，隨著發酵時間的延長，黃芪內生真菌發酵液對兩種致病菌的抑菌效果顯著增加（P＜0.05）。當發酵8 d后，發酵液對E.coli O157∶H7的抑菌圈、MIC和MBC值分別為（15.61±0.22）mm、6.25 mg/mL和12.5 mg/mL，對S.aureus ATCC 49775的抑菌圈、MIC和MBC值分別為（17.64±0.16）mm、3.13 mg/mL和6.25 mg/mL，說明黃芪內生真菌發酵液對上述2種食源性致病菌具有較好的抑菌效果。

2.5 抑菌機理初探

利用1 MIC的黃芪內生真菌發酵液處理E.coli O157∶H7和S.aureus ATCC 49775細胞，并用無處理細胞作為對照，揭示發酵液對受試菌株細胞形態的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，和正常細胞相比，在黃芪內生真菌發酵液的作用下，E.coli O157∶H7和S.aureus ATCC 49775的細胞形態都發生了變形、坍塌、細胞液外泄，這些是造成受試菌株死亡的重要原因之一，研究結果與一些天然產物抑菌機理的報道相似[16-18]。

圖3 黃芪內生真菌發酵液對大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌ATCC 49775細胞形態的影響Fig.3 Effect of fermentation liquid of endophytic fungiin A stra gali radix on the cell morphology of Esch erichia coli O157：H7 and Staphylococcus aureus ATCC 49775

3 結論

本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術揭示了黃芪發酵過程中內生真菌多樣性的變化，同時對發酵液的抑菌效果進行分析，并對其抑菌機理進行初步探討。結果表明，黃芪內生真菌發酵液中真菌的豐富度和多樣性隨著發酵時間的延長而減少，且真菌的種群組成也發生了變化。未發酵黃芪內生真菌的優勢菌屬為駝孢銹菌屬（Hemileia）和赤霉菌屬（Gibberella），而發酵8 d后，發酵液的優勢菌屬為Alternaria tenuissima和Undifilum oxytropis。同時，研究表明，黃芪內生真菌發酵液對E.coli O157∶H7的抑菌圈、MIC和MBC值分別為（15.61±0.22）mm、6.25 mg/mL和12.5 mg/mL，對S.aureus ATCC 49775的抑菌圈、MIC和MBC值分別為（17.64±0.16）mm、3.13 mg/mL和6.25 mg/mL。這種抑菌作用主要是通過破壞病原菌細胞形態，導致細胞塌陷和細胞液泄漏而造成。這一結果有助于拓展黃芪內生真菌發酵液的實用價值，并為黃芪類殺菌劑的開發提供理論依據。