鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠肝、腎的保護作用

劉澤鑫，劉 暢，錢 和

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

糖尿病是由高血糖引起的代謝疾病，當機體長期暴露于高血糖環境中，會導致各種組織（如眼、腎、肝、血管等）受到慢性氧化損傷而導致其功能障礙[1]。由于肝臟是調節糖代謝的重要器官，糖尿病更易加快肝臟損傷，并且絕大多數的Ⅱ型糖尿病患者通常伴有脂肪肝癥狀[2-3]。所以，保肝護肝對于糖尿病患者的治療也相當重要。糖尿病腎病是由糖尿病引發的最常見也是最嚴重的并發癥之一，并且已發展為糖尿病患者高死亡率的一個重要原因[4-5]。糖尿病會引起腎臟的惡化，其初期病理學表現為腎細胞基底膜增厚、系膜區擴張、足細胞損傷，后期發展為腎臟肥大、腎小球硬化[6]。

研究發現，氧化損傷是糖尿病并發癥中最重要的損傷途徑之一[7]。氧化應激是指體內氧化還原失衡，氧化作用顯著強于還原作用，從而刺激機體產生并且積累大量有害的氧化中間產物。當機體長期處于高血糖狀態會導致體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，ROS可對臟器造成直接或間接損傷[8]。因此，預防與改善高血糖導致的機體氧化應激對于緩解糖尿病肝腎損傷具有重要意義。

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）是一類自然界中廣泛存在的紅色擔子菌門真菌[9]。研究發現，S.pararoseus JD-2酵母具有培養方式簡單、易分離、宜高密度培養、高產類胡蘿卜素[10]等營養代謝物的特點[11]。研究表明，類胡蘿卜素有清除自由基[12]、保護細胞、增強細胞免疫功能，已被作為保健品功能因子廣泛應用于食品、藥品等行業[13]。S.pararoseus JD-2代謝產物富含類胡蘿卜素，其中主要成分是γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、圓酵母素和紅酵母紅素，其是維生素A前體，具有抗氧化和抗衰老活性[14-15]。由于酵母粉獨特的抗氧化作用，提示了其在Ⅱ型糖尿病及其并發癥中有可能發揮積極作用。

本研究采用了Ⅱ型糖尿病模型小鼠作為研究對象，觀察了鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠肝、腎病的保護作用，進一步研究了其可能的作用機制，為酵母粉治療糖尿病肝、腎損傷提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2-8：由本實驗室自行篩選所得。

斜面培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂20 g/L，pH6.0；種子培養基：葡萄糖20 g/L，玉米漿20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH 6.0；發酵培養基：葡萄糖40 g/L，玉米漿20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH 6.0。

丙酮、氯化鈉、檸檬酸、濃鹽酸、檸檬酸鈉（均為分析純）：國藥集團上海化學試劑有限公司；鹽酸二甲雙胍（藥品級）：山東司邦得制藥有限公司；蛋白定量試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）：南京建成生物工程研究所；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：美國Sigma公司；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6小鼠[SCXK（滬）2013-0018]：上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 儀器與設備

ROCHE羅氏活力血糖儀及試紙：德國Roche羅氏生物技術有限公司；AB204-N電子天平：Mettler-Toledo Group；Scientz-10nd冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；XSP-2C生物光學顯微鏡：蘇州歐卡精密光學儀器有限公司；ZNCL-GS智能磁力攪拌器：鄭州科華儀器設備有限公司；centrifugae5804R離心機：德國Eppendorf公司；WFJ7200可見分光光度計：龍尼柯上海儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鎖擲酵母粉的制備

將液氮保存的菌種接入斜面培養基，28℃恒溫培養48 h，分離得一環菌種接入裝有50 mL種子培養基的500 mL錐形瓶中，28℃、100 r/min搖床培養24 h得種子液。再將10 mL種子液接入裝有100mL發酵培養基的500 mL錐形瓶中，28℃、72 h連續培養后得到鎖擲酵母發酵液。發酵液4 000 r/min離心15 min，沉淀部分冷凍干燥后即為鎖擲酵母粉。

1.3.2 實驗動物與模型的建立

48只雄性C57BL/6小鼠，常規飼料適應性喂養7 d，禁食16 h，測定小鼠的空腹血糖值，隨機抽取8只為空白對照組（blank control，BC）。空白對照組小鼠喂養常規飼料，其余均喂養高脂肪飼料，喂養4周后所有小鼠均禁食過夜，給除空白組外的小鼠連續3 d腹腔注射100 mg/kg STZ檸檬酸緩沖液[16]，空白組小鼠注射同等劑量的檸檬酸緩沖溶液。3 d后禁食不禁水過夜，小鼠尾靜脈取血測空腹血糖值。若小鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L，即成功誘導40只小鼠糖尿病模型。

將以上40只Ⅱ型糖尿病小鼠隨機分5組，每組8只，分別為糖尿病模型組（diabetes model，DM）、陽性組（positive contral，PC）（鹽酸二甲雙胍1.5 mg/kg）、酵母粉低劑量組（FL）（鎖擲酵母粉1.5 g/kg）、酵母粉中劑量組（FM）（鎖擲酵母粉3.0 g/kg）、酵母粉高劑量組（FH）（鎖擲酵母粉6.0 g/kg），該5組均喂熱量飼料，鎖擲酵母粉溶于生理鹽水后經口灌胃，灌胃周期為8周。

1.3.3 小鼠體質量、進食量、飲水量及臟器指數的測定

每周同一時間記錄小鼠體質量；通過間隔2 d的飼料量與飲水量差值，計算小鼠每天的采食量、飲水量；實驗結束后，摘取心臟、肝臟、腎臟、脾臟并準確稱質量。

1.3.4 小鼠空腹血糖及血清生化指標的測定

每周同一時間禁食16 h不禁水，尾靜脈取血，血糖儀測定小鼠的空腹血糖值。實驗最后1 d，水合氯醛麻醉小鼠，摘取眼球收集血液，室溫靜置30 min，4℃、4 000 r/min離心15 min，分離得血清，-20℃儲藏，1周內用試劑盒測定血清MDA、SOD指標。

1.3.5 測定肝、腎組織中SOD和MDA的測定

實驗結束，快速取出肝、腎組織0.2 g，預冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，加入9倍4℃的生理鹽水，制備10%的組織勻漿液。組織勻漿液4℃、3 500 r/min離心10 min，測定上清液中的蛋白濃度、丙二醛、超氧化物歧化酶的含量。

1.3.6 肝、腎組織病理觀察

制備病理切片。實驗結束，快速取出小鼠部分肝、腎組織并用4%多聚甲醛固定1 d，不同濃度酒精梯度脫水、石蠟包埋，繼續切成4μm的薄片。最后，切片脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，脫水，樹膠封片，以備觀察。

1.4 數據統計與分析

選用統計學分析軟件IBMSPSSStatistics21.0，one-way ANOVA方法及Duncan檢驗分析數據，數值以（平均值±標準誤差）表示。當P＜0.05時表示有顯著性差異，且具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 鎖擲酵母粉對小鼠臟器指數的影響

表1 鎖擲酵母粉對小鼠臟器指數的影響Table 1 Effect of Sporidiob olus pararoseus powder on visceral index of mice

由表1可知，相比于空白組，小鼠的脾臟系數無顯著性差異（P＞0.05），心臟系數減小，肝和腎的臟器系數卻顯著增大（P＜0.05）。相比于模型組，陽性組可以緩解臟器損傷，不同劑量酵母粉組則可以更顯著地減輕腎臟指數（P＜0.01）。

2.2 鎖擲酵母粉對小鼠體質量、進食進水量及空腹血糖的影響

由圖1可知，空白組小鼠的體質量正常增長，并且飲水量、采食量無顯著差異（P＞0.05）。模型組小鼠在注射STZ后體質量明顯降低，但飲水、采食量明顯增多，這是糖尿病模型明顯癥狀，即“三多一少”。而陽性和不同酵母粉劑量組小鼠情況有所改善。

圖1 鎖擲酵母粉對小鼠體質量（a）、飲水量（b）、采食量（c）、空腹血糖值（d）的影響Fig.1 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on body weight(a),water intake(b),food intake(c),fasting blood glucose(d)of mice

小鼠的血糖水平在開始前都在4.7 mmol/L左右，當注射STZ造模，除空白組小鼠外，各組小鼠血糖值明顯上升（≥11.1 mmol/L），此即糖尿病小鼠癥狀。陽性組和酵母粉組小鼠血糖水平較模型組相比有所下降，雖然可以保持穩定，但沒有恢復到空白組水平。

眾多研究表明，Ⅱ型糖尿病是一種長期的代謝紊亂疾病，且以高血糖、胰島素抵抗和胰島素分泌相對不足為特征[17-18]。本研究主要通過高熱量飲食結合了STZ腹腔注射C57BL/6小鼠，誘導小鼠胰島素代謝紊亂，造成Ⅱ型糖尿病模型。由于高熱量飲食使小鼠產生胰島素抵抗，并且連續3 d的STZ腹腔注射直接破壞了體內部分胰島β細胞[19]，導致胰島素更加分泌不足，血糖代謝紊亂，因此，小鼠空腹血糖值上升。

2.3 鎖擲酵母粉對小鼠血清SOD、MDA的影響

由表2可知，相對于空白組小鼠，模型組小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低，丙二醛（MDA）濃度卻顯著上升（P＜0.01）。陽性組和酵母粉組均可顯著提高SOD含量，減少MDA的生成（P＜0.05）。

表2 鎖擲酵母粉對小鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影響Table 2 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on superoxide dismutase and malondialdehyde in serum of mice

2.4 鎖擲酵母粉對小鼠肝、腎組織中SOD、MDA的影響

由表3可知，相比于空白組小鼠，模型組小鼠肝、腎組織中MDA含量顯著增高（P＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽性組和酵母粉組不僅可以明顯提高SOD活性（P＜0.05），還可以降低MDA含量，其中酵母粉高劑量組效果最為顯著（P＜0.01）。

大量研究表明，糖尿病與氧化應激相關[20]。活性氧自由基（ROS）可以在機體各個組織中引起氧化應激，導致氧化還原平衡失衡，從而激活了一系列對氧化應激敏感的細胞因子，細胞內信號轉導被激活，進一步紊亂糖、脂代謝等通路，最終導致一系列糖尿病慢性并發癥，如糖尿病肝病、糖尿病腎病等[21]。自由基不僅可以造成生物膜的脂質過氧化損傷，直接或間接破壞細胞蛋白質、核酸、脂肪，而且會損傷內臟器官、免疫系統的形態功能，引起機體疾病[22]。

表3 鎖擲酵母粉對小鼠肝、腎超氧化物歧化酶和丙二醛的影響Table 3 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on superoxide dismutase and malondialdehyde in liver and kidney of mice

由于機體糖代謝紊亂，葡萄糖進行自身氧化，Ⅱ型糖尿病患者體內產生大量活性氧，并常伴有脂肪肝等[23-24]。當活性氧增加，機體內存在酶系抗氧化系統-超氧化物歧化酶（SOD）活性就會下降，導致機體不能及時清除自由基，產生了大量的脂質過氧化產物，最終使末端產物丙二醛含量升高[25]。由表2可知，Ⅱ型糖尿病小鼠經不同劑量的酵母粉干預后，均能夠不同程度地恢復小鼠機體的抗氧化抵御能力，清除脂質過氧化產物，小鼠血清中SOD活性水平有所上升，與模型組有顯著性差異（P＜0.05）；MDA濃度顯著下降，陽性對照組、中劑量組、高劑量組與模型對照組均有顯著差異（P＜0.05），高劑量組可恢復至空白組正常水平。表明酵母破壁粉可以提高小鼠體內抗氧化酶SOD的活性，顯著降低MDA水平。通過對表3中肝臟和腎臟數據分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠的肝臟、腎臟SOD和MDA水平均有極顯著差異（P＜0.01），說明糖尿病對肝、腎造成了實質性的損傷，組織內抗氧化酶系活力降低了，清除自由基能力減弱，產生氧化應激。但通過陽性藥物和不同劑量的酵母粉的治療，糖尿病小鼠的SOD活性水平均有所提高，除了低劑量酵母粉的肝臟MDA沒有顯著差異（P＞0.05），其余組的MDA含量均得到了有效的清除。由于劑量效應，高劑量組的治療效果比陽性藥物二甲雙胍有極顯著差異（P＜0.01），這也證明了酵母粉具有獨特的抗氧化性。

2.5 小鼠肝、腎病理觀察

由圖2可知，HE切片染色結果顯示，空白組小鼠腎病理切片結構清晰，系膜細胞與細胞外基質分布正常，無增生及纖維化現象。糖尿病組小鼠腎小球細胞數量增多，細胞間無明顯的間隙，細胞水腫，腎小球的系膜細胞基底膜增厚，系膜區擴張；陽性組和酵母粉組小鼠組織損傷較糖尿病組小鼠減輕，腎小球結構較為清晰，腎小管排列清楚，酵母粉高劑量組小鼠肝腎組織病理情況最佳。

圖2 小鼠腎臟、肝臟病理形態（HE染色，×200）Fig.2 Pathological morphology of kidney and liver of mice(HE staining,×200)

肝病理切片顯示，空白組小鼠肝細胞形態正常，無脂肪變性現象。模型組的小鼠肝臟明顯有各種脂肪空泡，出現大量雙核肝細胞。陽性組小鼠肝細胞脂肪性變基本消失，但仍可見少量肝細胞壞死碎片，酵母粉低組小鼠肝臟仍存在小泡性脂肪形變，并且伴有肝細胞碎片，酵母粉中、高劑量組小鼠肝細胞僅可見少量脂肪變性。

通過病理切片觀察，模型組小鼠肝組織結構紊亂，大部分肝細胞內出現大脂肪空泡與小脂肪空泡。二甲雙胍治療組可以明顯減輕Ⅱ型糖尿病造成的脂肪肝癥狀，而經鎖擲酵母粉治療后，中劑量與高劑量組的糖尿病小鼠的肝細胞排列基本規則，肝細胞內大脂肪空泡減少，尤其是高劑量的酵母粉的作用效果更為顯著。此結果表明，鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠的肝臟有保護作用，并且高劑量的酵母粉與陽性藥物二甲雙胍治療效果類似。在本項研究中，糖尿病小鼠經酵母粉治療8周后，病理檢查發現，腎小球系膜區增生減輕，腎小管恢復至正常狀態。

3 結論

本研究證明了鎖擲酵母（Sporidioboluspararoseus）JD-2-8粉能提高Ⅱ型糖尿病小鼠血清、肝和腎的抗氧化能力，提高肝腎內抗氧化酶SOD活性，加快清除氧化應激產物MDA含量，減少高血糖對肝、腎組織的損害，從而延緩Ⅱ型糖尿病的發展，其機制可能是通過改善肝、腎氧化應激、提高肝、腎抗氧化能力。