枸杞果酒低溫發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

董賽君，趙廷彬，李天瑜，牛思思，余君偉，喬長晟，，，*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津300457；3.杞源堂（天津）生物工程有限公司，天津 300457；4.杞源堂（寧夏）生物科技有限公司，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium chinense Mill.）屬茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）落葉灌木[1]。全世界的枸杞約有80多種，多數(shù)種分布在南、北美洲；在我國大部分地區(qū)均有種植，其中以寧夏中寧枸杞最為出名，是枸杞中的精品。現(xiàn)代科學(xué)測試分析和臨床試驗(yàn)證明，枸杞富含枸杞多糖、多種氨基酸、類胡蘿卜素、維生素及礦物質(zhì)，具有提高免疫力，抗癌，抗疲勞、輻射，耐缺氧，降血糖、血壓、血脂，延緩衰老，治療艾滋病和養(yǎng)顏美容等多種特效功能[2-3]。

果酒因酒精度低、健康聞名，被年輕人群所喜愛。近年來，已有研究者對適宜釀酒的水果（如蘋果、香蕉、芒果等）進(jìn)行了果酒釀造研究[1]。以枸杞為原料釀造的果酒，酒精度低，酒質(zhì)柔和爽口，果香味濃，營養(yǎng)價(jià)值高，基本保持了枸杞的天然營養(yǎng)成分，并且富含人體所需的各種氨基酸，多種維生素及礦物質(zhì)，是酒品中具有很大發(fā)展?jié)摿Φ木品N[4]。

低溫發(fā)酵可以延長發(fā)酵的時(shí)間，更能充分提取枸杞中的各類功能性因子和營養(yǎng)成分，還可以最大程度的保留枸杞清香典雅的果香，使其不被高溫破壞，并且使各種雜菌對枸杞果酒可能帶來的干擾和影響降至最低[5]。與枸杞本身相比，枸杞果酒不僅保留了原果實(shí)中特有的營養(yǎng)成分，且具有濃郁的枸杞香、酒香，味道酸甜可口，酒精度低，是滋補(bǔ)保健良品[6]。目前，關(guān)于枸杞果酒的研究多集中于營養(yǎng)成分變化[7-10]和生產(chǎn)工藝方面[11-13]。倪志婧等[14]探究了寧夏枸杞果酒最佳釀造工藝條件，生產(chǎn)的果酒果香濃郁，營養(yǎng)豐富。而有關(guān)枸杞果酒風(fēng)味方面的研究報(bào)道較少。

本試驗(yàn)以寧夏枸杞汁為原料，以感官評價(jià)為考察指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化枸杞果酒的發(fā)酵工藝，同時(shí)采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）對枸杞果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，以期為枸杞果酒的實(shí)際生產(chǎn)與應(yīng)用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞汁：寧夏杞源堂生物有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌株編號CGMCC 16558；白砂糖（食品級）：北京糖泰宗科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SⅡ型滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；TGL-16B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；頂空固相微萃取裝置（SPME手柄、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司；Agilent 7890A/5975CGC-MS聯(lián)用儀、Agilent HP-5色譜柱（60 m×0.25 mm×0.5μm）：美國安捷倫公司；IT-09A恒溫磁力加熱攪拌器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：從斜面上挑取一環(huán)釀酒酵母接種到酵母培養(yǎng)基中，200 r/min、28℃恒溫培養(yǎng)至OD600nm值為0.8～1.0；添加白砂糖、檸檬酸調(diào)節(jié)枸杞汁糖度、pH至一定值，煮沸滅菌20 min；將活化的菌種以一定量接入已冷卻的枸杞汁中；靜置于18℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵一段時(shí)間，收集發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min；分裝，巴氏殺菌，4℃保藏。

1.3.2 枸杞果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）初始pH值對枸杞果酒品質(zhì)的影響

將枸杞汁初始糖度調(diào)至12%，分別調(diào)節(jié)初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酵母添加量為0.5%，將其置于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進(jìn)行感官評定。

（2）糖度對枸杞果酒品質(zhì)的影響

將枸杞汁初始pH值調(diào)至5.0，分別調(diào)節(jié)初始糖度為8%、10%、12%、14%、16%，酵母添加量為0.5%，將其置于18℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進(jìn)行感官評定。

（3）發(fā)酵時(shí)間對枸杞果酒品質(zhì)的影響

將枸杞汁初始糖度調(diào)至12%，初始pH值調(diào)至5.0，酵母添加量0.5%，將其置于18℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)發(fā)酵5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進(jìn)行感官評定。

（4）酵母接種量對枸杞果酒品質(zhì)的影響

將枸杞汁初始糖度調(diào)至12%，初始pH值調(diào)至5，酵母接種量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，將其置于18℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進(jìn)行感官評定。

1.3.3 枸杞果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、初始糖度（D）為評價(jià)因素，每個因素選擇3個水平，以感官評價(jià)為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來優(yōu)化枸杞果酒發(fā)酵工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 枸杞果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for gojifruit wine fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）質(zhì)量指標(biāo)

酒精度、總糖、總酸、干浸出物：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；可溶性固形物：采用手持折光儀測定。

細(xì)菌菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[16]；大腸菌群數(shù)：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測定》[17]；致病菌檢測：參照GB 29921—2013《食品中致病菌限量測定》[18]。

（2）感官評價(jià)[19]

挑選9名（4女5男）在枸杞果酒行業(yè)從業(yè)5年及以上的專業(yè)人員作為評定人員，年齡在30～40歲。試驗(yàn)在寧夏杞源堂生物工程有限公司的標(biāo)準(zhǔn)品酒室完成。品評杯具為透明郁金香酒杯，樣品隨機(jī)放置。品評者分別從色澤、香氣、口感及狀態(tài)方面對樣品打分，滿分100分。具體感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 枸杞果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of gojifruit wine

（3）枸杞果酒中揮發(fā)性化合物分析[20]

樣品制備及分析：取5 mL樣品置于20 mL螺口頂空樣品瓶，加1 g氯化鈉，放入磁性轉(zhuǎn)子，樣品在恒溫磁力攪拌器中40℃平衡30 min，將萃取頭插入瓶內(nèi)頂空吸附30 min。萃取后將萃取頭插入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)樣口，250℃解吸8 min，同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

氣相色譜條件：色譜柱為AgilentCP-Wax（60 m×0.25mm×0.5μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；升溫程序?yàn)槠鹗?0℃維持1 min，按照3℃/min的速度升至220℃維持5 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍 20～450 m/z；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃。

揮發(fā)性物質(zhì)分析：化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫相匹配，并分析可能屬于枸杞果酒的風(fēng)味物質(zhì)，取匹配度≥80%的組分；同時(shí)采用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞果酒發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 初始pH值對枸杞果酒品質(zhì)的影響

圖1 初始pH值對枸杞果酒的影響Fig.1 Effect of initial p H on gojifruit wine

由圖1可知，不同初始pH值的枸杞汁發(fā)酵出的枸杞果酒感官評價(jià)差異較大，枸杞果酒的感官評分隨初始pH值的增大呈先增大后減小的趨勢；初始pH值過高或過低都不利于釀酒酵母的生長繁殖以及發(fā)酵，發(fā)酵效果不佳，以至于感官評價(jià)分值低，初始pH值為5.0時(shí)枸杞果酒的感官評價(jià)值為93分，酒體呈紅色調(diào)，澄清透明，有濃郁的酒香和果香，酸甜可口。因此，選擇初始pH值為5.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 初始糖度對枸杞果酒品質(zhì)的影響

圖2 初始糖度對枸杞果酒的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on gojifruit wine

由圖2可知，枸杞果酒的感官評分隨初始糖度的增大呈先增大后減小的趨勢；可能是酵母菌生長繁殖消耗部分糖，進(jìn)而糖度較低發(fā)酵得到的酒精度較低，感官評價(jià)分值較低，而糖度較高會影響釀酒酵母的生長繁殖，糖利用不完全導(dǎo)致口感較差；在初始糖度為14%時(shí)，枸杞果酒感官評分最高為93分，酒體呈金黃色，澄清透明，有濃郁的酯香，酸甜較可口。因此，選擇初始糖度為14%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對枸杞果酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，枸杞果酒的感官評分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢；發(fā)酵7 d和8 d條件下枸杞果酒感官評價(jià)分值較高，發(fā)酵第5 d和第6 d分值相對較低，故判斷發(fā)酵成熟階段可能在7～8 d；第9 d感官評價(jià)分值降低可能是由于發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)減少，酵母菌進(jìn)入衰減階段，菌體沉降死亡，酒體中溶入菌體內(nèi)容物而影響感官評價(jià)值。發(fā)酵7 d時(shí)枸杞果酒感官評價(jià)分值均為91分，酒體呈琥珀色，澄清透亮，酯香濃郁，帶有醇香。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為7 d進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對枸杞果酒的影響Fig.3 Effect of fermentation time on gojifruit wine

2.1.4 酵母接種量對枸杞果酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，枸杞果酒的感官評分隨酵母接種量的增大呈先增大后減小的趨勢；釀酒酵母接種量太高或太低均不利于枸杞果酒的發(fā)酵；接種量為0.1%時(shí)枸杞果酒感官評價(jià)分值最低，可能由于酵母菌接種量少，發(fā)酵能力差，產(chǎn)生酒精較少，感官評價(jià)分值較低，而接種量為0.9%時(shí)枸杞果酒感官評價(jià)分值也偏低，可能是酵母菌生長繁殖消耗大量糖，在酒精發(fā)酵階段糖的不足導(dǎo)致發(fā)酵效果不佳，從而影響感官評價(jià)分值；酵母菌接種量為0.5%時(shí)枸杞果酒感官評分最高為92分，酒體呈紅色調(diào)，澄清透明，有濃郁果香和酯香，口味微甜，酸度適合。因此，選擇酵母接種量為0.5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 酵母接種量對枸杞果酒的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on gojifruit wine

2.2 枸杞果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析

枸杞果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。由表3可知，發(fā)酵的最大影響因素是初始糖度（D），其次依次是初始pH值（A）和發(fā)酵時(shí)間（C），酵母添加量（B）影響最小。最佳發(fā)酵工藝組合為A3B3C3D3，即初始pH值為6.0，初始糖度為16%，發(fā)酵時(shí)間為8 d，酵母接種量為0.7%。在此條件下，枸杞果酒的感官評分為96分。

表3 枸杞果酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization of gojifruit wine

2.3 枸杞果酒中揮發(fā)性化合物分析

枸杞果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)與枸杞汁本身及酵母發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物有關(guān)。酵母菌不同接種量和糖度及接種時(shí)間的差異都會導(dǎo)致代謝物的差異。所檢測到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索后，獲得樣品揮發(fā)性化合物的種類及相對含量，結(jié)果見表4。

續(xù)表

由表4可知，對枸杞果酒的香氣成分進(jìn)行了定性分析，共鑒定出40種香氣成分，其中酯類物質(zhì)12種（40.59%），醇類物質(zhì)5種（30.50%），酸類物質(zhì)10種（17.80%），醛酮類物質(zhì)7種（3.60%）；相對含量較高的為醇類和酯類，共占總揮發(fā)性成分的71.09%。相對含量較高的香氣成分為異戊醇（23.60%）、辛酸乙酯（16.53%）、辛酸（9.84%）、苯乙醇（6.05%）、癸酸乙酯（7.04%）、2-苯乙基酯（5.90%）、癸酸（4.31%）[21-22]。

2.4 枸杞果酒質(zhì)量指標(biāo)

2.4.1 理化指標(biāo)

表5 枸杞果酒理化指標(biāo)Table 5 Physical and chemical indicators of gojifruit wine

由表5可知，枸杞果酒理化指標(biāo)符合國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2.4.2 微生物指標(biāo)

枸杞果酒細(xì)菌總數(shù)≤50 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)，確定了最佳枸杞果酒發(fā)酵條件為酵母添加量0.7%，初始糖度16%，初始pH值6.0，18℃條件下靜置發(fā)酵8 d，在此優(yōu)化條件下，枸杞果酒的感官評分為96分，酒精度為6.28%vol，殘?zhí)橇繛?.33 g/L；此時(shí)酒體呈金黃色，帶有紅色調(diào)，有淡淡的枸杞果香，酸甜可口，經(jīng)檢測分析，產(chǎn)品符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。同時(shí)通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析枸杞果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，枸杞果酒中相對含量較高的為醇類和酯類，共占總揮發(fā)性成分的71.09%，在發(fā)酵過程中醇類和酯類對枸杞果酒的香味有一定的積極作用。