朝鮮辣白菜中抗擴展青霉乳酸菌的篩選與鑒定

孫 悅，劉佳伊，杜 宏，李 婧，白鳳翎*，王君勇，勵建榮

（1.渤海大學 食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.寧夏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，寧夏 銀川 750000）

霉菌是一類絲狀真菌，廣泛分布于自然環境中[1]。霉菌污染導致水果、蔬菜、糧食作物和動物飼料等發生霉變，使食品和農產品失去價值[2-4]。其中擴展青霉（Penicillium expansum）是梨果采后腐爛病害的主要致病菌，其分泌產生的毒素對人體具有致癌、致畸、致突變等潛在威脅[5]。控制食品和農產品中霉菌的方法包括物理法、化學法和生物法。物理法（加熱、紫外照射、微波等）[6]通常會影響食品的感官性狀，造成營養物質流失。化學法應用山梨酸鹽和丙酸鹽等化學防腐劑控制霉菌的生長，但存在一定的安全隱患。生物法主要應用茶多酚、殼聚糖、溶菌酶等生物制劑抑制霉菌的生長，具有綠色、安全、高效的特點，已成為食品防腐領域研究的熱點[7]。

乳酸菌作為一種新型生物制劑廣泛應用于肉制品、乳制品、果蔬制品等防腐保鮮，其主要通過產生的有機酸、細菌素、過氧化氫等代謝物質抑制食品中腐敗微生物的生長[8]。李院等[9]從醬菜中分離得到3株對青霉拮抗作用較強的乳酸菌L511、L520、L544，抑菌圈直徑均＞18.0 mm，并推測抑菌物質是有機酸類；李曉婷[10]從內蒙古傳統發酵食品中分離得到對黃曲霉拮抗活性較強的乳酸菌ALAC-1、ALAC-4，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為62.50 mg/mL、31.25 mg/mL；尹雪等[11]從新疆傳統發面面肥中分離得到3株對黃曲霉抑制效果較好的乳酸菌F3、F11、F12，抑菌圈直徑分別為23.0 mm、45.0 mm、18.0 mm；EBRAHIMIM等[12]從傳統發酵食品中分離得到1株拮抗活性較強的小球菌，對黃曲霉和黑曲霉的抑制率分別為70.32%和98.8%。目前，關于從朝鮮辣白菜中分離出抗擴展青霉乳酸菌的相關報道較少。

朝鮮辣白菜是以中國大白菜為主要原料，利用天然微生物發酵而成的傳統發酵食品，在發酵過程和產品中含有豐富的乳酸菌資源[13-14]。因此，本研究采用菌餅法從朝鮮辣白菜中分離對擴展青霉具有拮抗活性的乳酸菌，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定，并對其抑菌物質的特性及抑菌機理進行初步研究，為研發一種控制霉腐微生物的乳酸菌生物防腐劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

朝鮮辣白菜：錦州市金凌商場、錦州白樓農貿市場、錦州牡丹農貿市場等；擴展青霉（Penicillium expansum）CMCC 3.3703：中國醫學細菌菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、PDA液體培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

MRS固體培養基：蛋白胨10.0 g，酵母粉4.0 g，牛肉粉5.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，硫酸鎂0.2 g，吐溫-80 1.0 mL，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.0～6.4，121 ℃滅菌15 min。MRS液體培養基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 試劑

乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸（均為分析純）：美國Sigma公司；胃蛋白酶（15 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）：上海華藍化學科技有限公司；Taq PCR Master mix、細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、DNA Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管：杭州天合微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：東聯哈爾（北京）儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；ABI stepone plus聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機：德國艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；S-4800掃描電鏡：日本日立公司；SPX-250智能生化培養箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；UV2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；FA1004精密電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器：德國IKA公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；KJELTEC 8000凱氏定氮儀：丹麥福斯公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

參照文獻[15]并稍作修改。無菌條件下取出適量朝鮮辣白菜樣品，采用接種環挑取每個樣品汁液1環，劃線于含1.0%CaCO3的MRS固體培養基，37℃條件下培養48 h，選取有溶鈣圈的乳白色典型菌落進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色。

1.3.2 乳酸菌抗擴展青霉活性的測定

乳酸菌無細胞上清液（cell free supernatant，CFS）的制備：參照文獻[16]并稍作修改。在MRS液體培養基中接種乳酸菌菌株，37℃培養并傳代2次，再以2%（V/V）的接種量接種于1.0 LMRS液體培養基中，37℃培養12～24 h。4℃、6 000 r/min條件下離心15 min，上清液經0.45μm的濾膜過濾除菌，得到乳酸菌CFS，4℃保存備用。

抗擴展青霉活性的測定：參照文獻[17]中的菌餅法并稍作修改。在無菌條件下，挑取1環擴展青霉于PDA培養基中，25℃避光培養5 d。用直徑為7.0 mm專用打孔器從培養5 d的擴展青霉菌落邊緣制取菌餅，接種于含10%乳酸菌CFS的PDA培養基中央。25℃避光培養，以接種擴展青霉的PDA培養基為空白對照，計算乳酸菌對擴展青霉的抑菌率，其計算公式如下：

式中：d0為對照組擴展青霉菌落直徑，mm；dx為實驗組擴展青霉菌落直徑，mm。

1.3.3 乳酸菌菌株鑒定

形態學鑒定：將分離的乳酸菌劃線于MRS培養基，30℃培養24 h，觀察菌落形態。采用革蘭氏染色法染色并在顯微鏡下觀察。

生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[19]對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：參照文獻[20]對分離乳酸菌的16S rRNA進行PCR擴增。PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 乳酸菌對擴展青霉的拮抗機理研究

pH對乳酸菌抗擴展青霉活性的影響：采用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS的pH分別調至2.5、3.0、4.0、5.0、6.0，以未處理的乳酸菌CFS作對照。

溫度對乳酸菌抗擴展青霉活性的影響：將乳酸菌CFS分別在50℃、70℃、100℃處理30 min、121℃處理15 min，以未處理的乳酸菌CFS作為對照組。

蛋白質對乳酸菌抗擴展青霉活性的影響：采用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS的pH分別調至胃蛋白酶（pH 2.0）、木瓜蛋白酶（pH 7.0）、中性蛋白酶（pH 7.0）、胰蛋白酶（pH 7.5）的最適pH，再分別加入相應的蛋白酶，使其最終濃度為1.0 mg/mL，室溫條件下處理4 h，以未處理的乳酸菌CFS作為對照組。

測定乳酸菌CFS中乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸的含量，采用MRS液體培養基配制與乳酸菌CFS中相同濃度的乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸以及四種混合酸，測定其對擴展青霉的抑菌活性。

1.3.5 乳酸菌CFS對擴展青霉細胞結構的影響

參照文獻[21]并稍作調整，研究乳酸菌CFS對擴展青霉細胞結構的影響。以不加乳酸菌CFS為對照組，5.0 mL乳酸菌CFS中加入200μL指示菌，30℃、150 r/min條件下培養12 h。4℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。在2.5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，除去殘留戊二醛，洗滌后菌體用無菌水懸浮，用膠頭滴管取適量滴于潔凈蓋玻片，真空干燥12 h，噴金鏡檢。

1.3.6 測定方法

乙酸、乳酸、丙酸的測定：參照文獻[22]；苯乳酸的測定：參照文獻[23]。

2 結果與分析

2.1 抗擴展青霉乳酸菌的分離和初篩

從朝鮮辣白菜中共分離得到62株具有白色溶鈣圈的典型菌落，經革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗確認45株為乳酸菌。采用菌餅法從45株乳酸菌中篩選出5株對擴展青霉拮抗活性較強的乳酸菌，分別編號為PC-1、PC-2、PC-3、PC-4、PC-5，其對擴展青霉的抑制率分別為60.37%、61.53%、68.62%、59.97%、63.44%。其中，乳酸菌PC-3的抑菌率最高，因此，選擇菌株PC-3進行下一步研究。

2.2 乳酸菌PC-3對擴展青霉的抑菌效果

菌株PC-3對擴展青霉的抑菌效果見圖1。

圖1 擴展青霉的生長情況（A）及菌株PC-3對其的抑菌作用（B）Fig.1 Growth situation of Penicillium expansum(A)and antimycotic activity of strain PC-3 on it(B)

由圖1可知，無乳酸菌PC-3 CFS添加，擴展青霉生長茂盛，布滿整個平板；添加乳酸菌PC-3 CFS后，擴展青霉的生長受到明顯的抑制，抑菌率為68.62%。

2.3 乳酸菌PC-3的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

菌株PC-3的菌落形態及細胞形態見圖2。

圖2 菌株PC-3的菌落形態（A）及細胞形態（B）Fig.2 Colony(A)and cell(B)morphology of strain PC-3

由圖2A可知，菌株PC-3的菌落呈乳白色，不透明，中央凸起，邊緣整齊，表面光滑，菌落直徑為0.5～2.0 mm，具有典型乳酸菌生長特征。由圖2B可知，菌體PC-3為革蘭氏陽性菌，菌體為短桿狀排列，無鞭毛，無芽孢。

2.3.2 生理生化試驗結果

菌株PC-3的生理生化試驗結果見表1。

表1 菌株PC-3的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain PC-3

由表1可知，菌株PC-3不能液化明膠，不能發酵葡萄糖酸鹽，能發酵利用除棉籽糖、鼠李糖、木糖以外的其他糖類。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[18]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[19]初步鑒定菌株PC-3為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.3.3 分子生物學鑒定

菌株PC-3的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖見圖3。由圖3可知，在堿基長度為1 500 bp處有特異性條帶，與目的基因相符，表明目標片段被成功擴增。PCR擴增產物測序結果在NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA5.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株PC-3和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）CP022709.1聚于一支，親緣關系最近，相似度達96%。因此，鑒定菌株PC-3為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。

圖3 菌株PC-3 16S rRNA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene of strain PC-3

圖4 基于16S rRNA基因序列菌株PC-3的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PC-3 based 16S rRNA gene sequences

2.4 乳酸菌拮抗作用及機理的研究

2.4.1 pH對乳酸菌PC-3 CFS抗擴展青霉的影響

不同pH值對菌株PC-3 CFS抑制擴展青霉的影響見圖5。

圖5 不同pH值對菌株PC-3 CFS抗擴展青霉的影響Fig.5 Effect of different pH on the antimycotic activity of strain PC-3 CFS on Penicillium expansum

由圖5可知，隨pH值逐漸升高，菌株PC-3 CFS對擴展青霉的抑菌率呈先上升后下降趨勢。當pH值為4.0時，菌株PC-3 CFS對擴展青霉抑菌效果最好，抑菌率為64.97%；當pH值為6.0時，菌株PC-3 CFS基本失去對擴展青霉的抑菌作用。

2.4.2 溫度對乳酸菌PC-3 CFS抗擴展青霉的影響

溫度對菌株PC-3 CFS抑制擴展青霉影響見圖6。

圖6 溫度對菌株PC-3 CFS抗擴展青霉的影響Fig.6 Effect of temperature on the antimycotic activity of strain PC-3 CFS on P enicillium expansum

由圖6可知，菌株PC-3 CFS經50℃處理30 min，對擴展青霉的抑菌率為66.54%，抑菌效果最強；經70℃、100℃處理30 min和121℃處理15 min后抑菌率分別下降至43.07%、20.13%和10.07%，表明菌株PC-3 CFS對擴展青霉的抑菌率隨溫度的升高而逐漸減弱，溫度對抑菌活性具有顯著的影響（P＜0.05）。

2.4.3 蛋白質酶對乳酸菌PC-3 CFS抗擴展青霉的影響

乳酸菌PC-3 CFS分別經木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶室溫下處理4 h，菌株PC-3 CFS對擴展青霉的抑菌率分別為60.66%、60.37%、60.44%、59.96%，無顯著差異（P＞0.05）。因此，初步推測其抑菌活性物質為非蛋白類。

2.4.4 乳酸菌抗擴展青霉的活性物質分析結果

乳酸菌CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸的含量分別為6.52μg/mL、2.62μg/mL、0.05μg/mL和1.86μg/mL，含相同質量濃度乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸以及四種混合酸的MRS液體培養基對擴展青霉的抑菌結果見表2。

表2 乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸及混合酸對擴展青霉的抑菌率Table 2 Anti-mycotic rate of lactic acid,acetic acid,propionic acid,phenyl lactic acid and mixed acids on Penicillium expansum

由表2可知，乳酸和乙酸對擴展青霉的抑菌率分別為67.58%和66.73%，丙酸和苯乳酸對擴展青霉均沒有抑菌效果；將乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸按比例組合成混合酸，抑菌率為68.77%。結果表明，菌株PC-3 CFS中的主要抑菌活性物質為乳酸和乙酸。ANA G等[24]研究發現，乳酸菌抑制真菌的活性物質為有機酸類物質，與本研究結果相似。

2.5 乳酸菌PC-3 CFS對擴展青霉細胞結構的影響

菌株PC-3 CFS對擴展青霉細胞結構的影響見圖7。

圖7 擴展青霉分生孢子形態（A）及菌株PC-3 CFS對其的影響（B）Fig.7 Conidial morphology of Penicillium expansum(A)and effect of strain PC-3 CFS on it(B)

由圖7A可知，未經菌株PC-3 CFS抑制的擴展青霉分生孢子圓潤，表面光滑，結構完整。由圖7B可知，經菌株PC-3 CFS處理后，擴展青霉分生孢子胞壁結構不完整，邊緣模糊，胞內物質外泄。結果表明，菌株PC-3 CFS對擴展青霉分生孢子胞壁結構具有較強損傷作用，其作用機理和對擴展青霉分生孢子胞壁結構的破壞過程需進一步研究。DA R N A等[25]研究表明，用水楊酸處理擴展青霉，細胞結構溶解，蛋白質泄露，與本研究結果相似。

3 結論

本研究從朝鮮辣白菜中分離出對擴展青霉拮抗作用較強的乳酸菌PC-3，經形態觀察、生理生化和分子生物學鑒定為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。菌株PC-3 CFS對擴展青霉的抑菌活性隨pH值的升高呈現先上升后下降的趨勢，隨溫度的升高而下降。蛋白酶的添加對其抑菌活性沒有影響，初步證明抑菌成分為非蛋白類物質。菌株PC-3 CFS中乳酸和乙酸的含量為6.52μg/mL、2.62μg/mL，對擴展青霉抑菌率分別為67.58%和66.73%，乳酸和乙酸為菌株PC-3抑制擴展青霉的主體活性成分。經掃描電鏡觀察，菌株PC-3抑制擴展青霉活性的機制主要使其為細胞壁結構失去完整性，導致細胞原生質泄露。該研究為研發一種控制食品和農產品中霉菌的生物防腐劑奠定基礎。