海洋低溫膽固醇氧化酶生產菌株誘變育種及酶學性質研究

張慶芳，希 倫，劉 洋，于 爽，李美玉，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

膽固醇是醫學診斷中極為重要的指標[1]，在正常的生理條件下，血液中膽固醇的濃度保持在一定的合理范圍內[2]。而當出現肝臟病變情況下，其濃度有一定幅度的降低[3-4]。相關研究還發現，黃疸和腎病綜合征患者血清的膽固醇水平存在一定幅度的增加，因而就可根據血清膽固醇水平來進行肝臟功能檢測[5-6]，膽固醇氧化酶是一種常用于這方面檢測的酶[7]。不僅如此，膽固醇氧化酶還在其他許多領域有著極為重要的意義，如用于殺蟲與許多甾醇和非甾醇的生物轉化[8-9]及抗真菌傳感器中[10-11]。

雖然產膽固醇氧化酶的菌株已經在一些微生物中有發現，但大部分都是中、高溫酶，且酶活性不高，一定程度上限制了酶的應用。相對于陸源生物，海洋生物因其特殊的棲息環境，其產生的酶類具有顯著特異性（如耐壓、耐堿、耐鹽及耐冷等），其更符合現代生物技術和不同加工產業的應用要求。

本研究利用本實驗室所保藏的一株來源于海洋的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）XLH059作為出發菌株進行紫外誘變、化學誘變及復合誘變，研究誘變菌株膽固醇氧化酶的酶學性質，為擴大膽固醇氧化酶的應用范圍奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）XLH059：遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）、4-氨基-安替比林、氯化鈉（均為分析純）：吉林東博生物公司；瓊脂（生化試劑）、硫酸鎂、磷酸二氫鉀（均為分析純）：北京賽德科技有限公司；膽固醇（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.3 培養基

液體富集培養基：膽固醇0.1%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，FeSO40.000 1%，pH 7.0。

篩選培養基：酵母粉0.5%，膽固醇0.1%，吐溫-80 0.1%，瓊脂2%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，FeSO40.000 1%，pH 7.0。

種子培養基：葡萄糖2%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

發酵培養基：酵母粉0.5%，膽固醇0.1%，吐溫-80 0.1%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，FeSO40.000 1%，pH 7.0。

上述培養基滅菌條件：121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

GS-158低溫臺式離心機、J21-M高速冷凍離心機：美國BECKMAN公司；CH1015超級恒溫水浴槽：上海恒平科學儀器有限公司；Inazge MlasterRVDS電泳成像系統：美國Parmacia Biotech公司；PB-10型精密pH計：上海精密儀器廠；DZF-6052真空干燥箱：上海風棱實驗設備有限公司；HVE-50超高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞懸浮液制備

將活化的XLH059菌種接種于種子培養基中培養，培養至對數生長末期，4 ℃離心（4 000 r/min、5 min），收集沉淀得菌體。用0.85%無菌生理鹽水將菌體洗滌2次，配制成菌懸浮液，備用。

1.3.2 紫外誘變

取10 mL上述菌懸液加入平板中，并將平板置于磁力攪拌器上，在30 W紫外燈下距離20 cm，處理30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s。紫外線照射前后的菌懸液同時稀釋，取0.1 mL涂布在篩選培養基上，26℃黑暗條件下培養24 h[13-14]。以誘變時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制致死率曲線。致死率計算公式如下：

1.3.3 化學誘變

取0.4 mL上述菌懸液，加入0.5 mL醋酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 4.4），再加入0.1 mL（5 mg/mL）的亞硝酸鈉溶液，于26 ℃條件下處理一定時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）后，加入5倍的磷酸緩沖液（pH8.6）解毒，各誘變時間的菌懸液同時稀釋，各取0.1 mL涂布在篩選培養基上，在26℃條件下培養24 h[16]。以誘變時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制致死率曲線。

1.3.4 復合誘變

復合誘變即先在誘變效果最好的紫外條件下處理菌體，再在避光下繼續進行化學誘變[17]，經過復合誘變的菌株進行液體搖瓶發酵試驗，測定其產膽固醇氧化酶活力。

1.3.5 優良突變菌株的傳代試驗

將得到的具有高產膽固醇氧化酶的優良突變菌株在平板上轉移5次。通過發酵測定膽固醇氧化酶活力，考察其遺傳穩定性。

1.3.6 粗酶液制備

3.雙腔吸蟲病。(1)定期驅蟲；(2)糞便堆積發酵處理；(3)加強牛群管理,避免到利于中間宿主陸地螺及螞蟻生存條件的地區放牧。

將誘變得到的單菌落接種到種子培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，在25℃、200 r/min條件下培養12 h。然后，將1mL液體種子接種到發酵培養基中，裝液量為100mL/250mL，在25℃、200 r/min條件下培養48 h。發酵液經8 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。

1.3.7 膽固醇氧化酶酶活的測定[18]

（1）H2O2標準曲線的繪制

取酶活顯色體系3 mL（pH7.5磷酸鉀緩沖液0.1 mol/L 1 mL，4-氨基安替比林3 mmol/L 1 mL，苯酚溶液18 mmol/L 1 mL，過氧化物酶7 000 U/L 200μL）于試管中，37℃恒溫水浴中保溫3 min，分別加入濃度為2.5 mmol/L的H2O2溶液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL，反應5 min后測定OD500nm值。以OD500nm值（x）為橫坐標，H2O2濃度（y）為縱坐標，繪制H2O2標準曲線。H2O2對OD500nm值的回歸方程為y=0.413x-0.127 9，相關系數R2=0.999 4，線性關系良好，可用于膽固醇氧化酶活力的測定。

（2）膽固醇氧化酶活性的測定

在試管中取3 mL酶活化顯色系統，在試管中加入膽固醇/異丙醇溶液（含Triton-100 4.36%）150μL。在37℃恒溫水浴中孵育3 min，加入100μL發酵上清液，并在5 min后測量OD500nm值。根據H2O2標準曲線回歸方程計算膽固醇氧化酶酶活。

膽固醇氧化酶活力定義：在37℃、pH 7.5條件下，1 min催化1μmol膽固醇氧化成膽甾-4-烯-3-酮所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.8 膽固醇氧化酶酶學性質研究

（1）酶最適作用溫度

根據膽固醇氧化酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同溫度條件下（10～60℃，間隔5℃）測定其酶活，并繪制溫度-相對酶活折線圖。相對酶活：以該組最大酶活為100%，其他酶活占其的百分比為該酶活的相對酶活。

（2）酶的熱穩定性

根據膽固醇氧化酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同溫度條件下（10～60℃，間隔10℃）保溫5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，測定其酶活，并繪制時間-相對酶活折線圖。

（3）酶最適作用pH值

根據膽固醇氧化酶酶活測定方法，將不同pH值（3.0～9.0）的緩沖液代替酶活顯色體系中的磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5），37℃保溫5 min后加入20μL酶液，反應5 min，置于沸水浴中終止反應，測定OD500nm值變化，測定其酶活，并繪制pH值-相對酶活折線圖。

（4）酶的pH值穩定性

將酶液分別置于0.1 mol/L pH值（3.0～9.0）的緩沖液中適當稀釋，在25℃條件下靜置1 d，根據膽固醇氧化酶酶活測定方法測定其酶活，并繪制pH值-相對酶活折線圖。

不同pH緩沖液：pH 3.0～5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液0.1 mol/L；pH 6.0～7.5磷酸鉀緩沖液0.1 mol/L；pH 8.0～9.0 Tris-HCl 0.1 mol/L。

（5）金屬離子對酶活的影響

在酶最適作用條件下，向酶反應體系中各加入各種金屬陽離子Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Hg+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+，使各反應體系中金屬離子終濃度為0.003 5 mol/L，測定膽固醇氧化酶相對酶活，做3組平行試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株誘變結果

2.1.1 紫外誘變結果

（1）紫外誘變致死率曲線

紫外誘變致死率實驗結果見圖1。由圖1可知，當誘變時間為30 s時，致死率為29.6%，隨著誘變時間的增加，致死率不斷變大，在誘變時間達到120 s時，菌體致死率達到了88.6%；而當誘變時間為150 s時，致死率為94.6%，誘變180 s時，致死率為98.7%。一般認為誘變后菌株的致死率在80%～90%之間，誘變效果較好，可以保證菌株最大程度的突變[19]。因此，選取致死率88.6%時的誘變時間120 s對原始菌株進行紫外誘變。

圖1 紫外誘變菌株致死率曲線Fig.1 Lethality curve of ultraviolet mutated strains

（2）紫外誘變結果

將紫外誘變后得到的67株菌株接種于篩選固體培養基平板，并在25℃條件下靜置培養24 h。之后選取菌落，采用點種法點在兩個新的平板上，菌落之間留有充分的間隙，兩個平板要完全一致做好標記。其中一個平板的菌落染色，將其浸入含有0.5%膽固醇的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）中；3 000 U/L辣根過氧化物酶；1.7%4-氨基安替吡啶和6%苯酚的濾紙平鋪在平板上，在室溫下避光溫育24 h。通過觀察菌落周圍形成的粉紅色的大小及顏色的深淺[20-21]篩選得到17株菌株，將這些菌株進行搖瓶液體發酵24 h，測定膽固醇氧化酶活力，計算酶活提升率。

5株紫外誘變菌株產酶活力與出發菌株XLH059比較有較大提高，結果見表1。由表1可知，突變菌株XL-a21的產酶活力提高最大，是原始菌株的1.83倍。由此可證明紫外誘變可以有效地提高菌株產膽固醇氧化酶的活性。

表1 紫外誘變菌株篩選結果Table 1 Screening results of ultraviolet mutated strains

2.1.2 化學誘變結果

（1）化學誘變致死率曲線

化學誘變致死率實驗結果見圖2。由圖2可知，隨著處理時間的增加，菌株的致死率不斷提高。處理時間為10 min時，致死率僅為29.5%；而當處理時間達到30 min時，菌株致死率達到了85.1%；處理時間為40 min時，致死率＞90%，達到了94.6%。為了保證菌株的存活率不至于過低，又能使菌株得到最大程度的誘變，本實驗最終選擇30 min為最佳化學誘變處理時間。

圖2 化學誘變菌株致死率曲線Fig.2 Lethality curve of chemical mutated strains

（2）化學誘變結果

選擇最佳誘變時間30 min，稀釋涂布培養共得到菌株52株。對這52株菌株進行菌落染色法篩選，得到粉紅色明顯的菌株13株，將這13株目的菌株作為重點觀察對象，進行液體搖瓶發酵試驗以考察其產膽固醇氧化酶活性，其中酶活提升率高的3株菌的酶活力與酶活提升率結果見表2。

表2 化學誘變菌株篩選結果Table 2 Screening results of chemical mutated strains

由表2可知，菌株XL-b12酶活力最高，經化學誘變后酶活性是出發菌株的1.38倍。相較于紫外誘變，化學誘變無論是菌株數量還是酶活提升都有一定差距。

2.1.3 復合誘變結果

出發菌株先在紫外條件下處理120 s，再在避光條件下化學處理30 min。涂布篩選，得到菌株63株，得到粉紅色明顯的菌株14株，將這14株目的菌株作為重點觀察對象，進行液體搖瓶發酵試驗，測定產膽固醇氧化酶活力，其中有5株菌株的產酶活力有較大提高結果見表3。由表3可知，菌株XL-c23膽固醇氧化酶活是出發菌株的2.43倍，高于其他菌株。結果表明，復合誘變效果優于紫外誘變和化學誘變單一處理效果。

表3 復合誘變菌株篩選結果Table 3 Screening results of compound mutated strains

2.2 突變菌株遺傳穩定性

對產酶活力提高較大的5株突變菌株XL-c5、XL-c23、XL-c31、XL-c42和XL-c55進行傳代穩定性考察。將突變菌株分別在LB培養基平板上連續傳5代后，搖瓶發酵考察其遺傳穩定性，結果見表4。由表4可知，菌株XL-c31經5次傳代后，酶活呈現衰退，而菌株XL-c5、XL-c23、XL-c42、XL-c55經傳代后酶活穩定，并且菌株XL-c23酶活力最高，為1.026 U/mL。

表4 突變株遺傳穩定性試驗Table 4 Genetic stability of mutant strains

2.3 酶學性質分析

2.3.1 酶最適作用溫度

由圖3可知，菌株XL-c23產膽固醇氧化酶的最適反應溫度為30℃，30℃后酶活力逐漸下降，10～45℃酶活力保持在50%以上，其中20～40℃酶活力可以保持在80%以上，符合海洋細菌低溫酶特性。

圖3 溫度對膽固醇氧化酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on cholesterol oxidase activity

2.3.2 酶的熱穩定性

由圖4可知，溫度在10～40℃范圍內的菌株XL-c23產膽固醇氧化酶活性在20 min后還可以保持＞50%的酶活性，并且10～30℃可以保持＞80%的活力。說明該酶在較低的溫度（10～30℃）條件下能保持良好的穩定性，溫度＞40℃之后，酶活力迅速下降。

圖4 膽固醇氧化酶的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of cholesterol oxidase

2.3.3 酶最適作用pH值

由圖5可知，當pH值＜6.0或＞8.0時，菌株XL-c23產膽固醇氧化酶活性急劇降低。膽固醇氧化酶最適pH值為7.0。

圖5 pH值對膽固醇氧化酶酶活的影響Fig.5 Effect of pH on cholesterol oxidase activity

2.3.4 酶的pH值穩定性

由圖6可知，菌株XL-c23產膽固醇氧化酶在pH 6.0～8.0有較好的穩定性，相對酶活均可以達到80%以上。

圖6 膽固醇氧化酶的pH穩定性Fig.6 p H stability of cholesterol oxidase

2.3.5 金屬離子對酶活的影響

由圖7可知，大部分的金屬離子都對菌株XL-c23產膽固醇氧化酶的活性有明顯抑制作用；Cu2+對膽固醇氧化酶有促進作用。Mn2+對膽固醇氧化酶活性有一定抑制作用，但仍能保持90%以上的酶活；Hg+對膽固醇氧化酶活性有嚴重抑制作用，相對酶活＜40%。

圖7 金屬離子對膽固醇氧化酶活的影響Fig.7 Effect of metal ions on cholesterol oxidase activity

3 結論

利用實驗室保藏產膽固醇氧化酶蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）XLH059作為研究對象，運用紫外誘變、化學誘變、紫外-化學復合誘變3種方法對其進行誘變育種以提高其產酶活力。結果表明，雖然各種誘變方法都可以提高菌株產膽固醇氧化酶的能力，但誘變效果卻有很大差異。從實驗結果可以看出復合誘變得到的突變菌株整體產酶水平又優于紫外誘變與化學誘變。本試驗最終獲得產酶活力最高的復合突變菌株XL-c23，其產酶活力最高為0.989 U/mL，是原始菌株的2.43倍，并且通過5代傳代試驗證明其產酶能力穩定。確定菌株XL-c23作為發酵條件優化實驗的出發菌株。經試驗得到該酶的最適pH值為7.0，酶活力在pH6.0～8.0有較好的穩定性。該酶的最適溫度為30℃，30℃以下酶活力較為穩定，在20～40℃酶活力可以保持在80%以上，符合海洋細菌低溫酶特性。