腦梗死患者COX-1及COX-2基因多態性與阿司匹林抵抗的相關性分析

李 霞，王 煒，趙仕琪，槐瑞雪，史肖鶴，李世平，董 梅

隨著基因技術的飛速發展，越來越多的研究顯示遺傳因素可能與阿司匹林抵抗(AR)相關，阿司匹林為非選擇性COX抑制劑，通過與環氧合酶(COX)不可逆乙?；磻姑甘Щ?，抑制花生四烯酸(AA)代謝，阻斷血栓素A2(TXA2)介導的血小板聚集。阿司匹林對COX-1及COX-2兩種同工酶均有不可逆抑制作用，但對COX-1的抑制強度是COX-2的170倍，故抗栓療效主要取決于對COX-1的抑制程度。關于COX-1基因多態性已被廣泛關注，國內外有文獻報道，COX-1受體上-1676A>G及C50T、-A842G基因多態性可能與AR相關[1]，但尚存在爭議。COX-2屬于誘生型酶，在動脈粥樣硬化的慢性炎癥過程中參與血栓形成。有研究報道，位于COX-2基因啟動子區的-765G/C多態性可能與AR相關[2]。

腦梗死復發因素眾多，關于AR基因多態性與腦梗死復發相關研究較少，本研究旨在探討COX基因多態性與腦梗死患者發生AR的關系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 采用前瞻性隊列研究，選取2014年10月-2015年6月在河北醫科大學第二醫院神經內科住院的急性腦梗死患者，入選患者均行頭部MR 1.5T檢查證實有新發梗死灶。所有患者均簽署知情同意書。共有70例患者進行血栓彈力圖(TEG)檢測和COX-1及COX-2基因分型。住院治療穩定后，規律口服ASP 100 mg/d，半年后進行臨床隨訪。通過門診及電話隨訪。以患者發病時間為起點，進行6個月隨訪。主要終點事件是指腦梗死復發，次要終點事件包括腦出血、心肌梗死以及其他原因導致的死亡。排除標準：(1)短暫性腦缺血發作(TIA)；(2)服用其他抗血小板藥物或抗凝藥；(3)有嚴重消化性潰瘍或其他消化系統疾??；(4)血小板計數<100×109/L或>400×109/L、血紅蛋白<90 g/L或>169 g/L；(5)有嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液病、惡性高血壓、嚴重感染及免疫系統疾病；(6)近期有活動性出血者；(7)房顫；(8)心源性腦梗死。剔除標準：(1)臨床資料不全；(2)停藥或間斷服用ASP。

1.2 方法 初發缺血性腦卒中患者在規律服用ASP 100 mg/d 7 d后晨起空腹采肘部靜脈血5 ml，存放于枸櫞酸鈉抗凝管，采用TEG-5000血栓彈力圖儀(美國Haemonetics公司)及配套試劑檢測。阿司匹林抵抗(AR)定義：TEG通過阿司匹林誘導劑花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，使用3個通道(高嶺土、激活劑F和激活劑F+AA)進行檢測。阿司匹林抑制率=(AA誘導的最大血凝塊強度-纖維蛋白的最大血凝塊強度)/(凝血酶誘導的最大血凝塊強度-纖維蛋白的最大血凝塊強度)×100%。阿司匹林抑制率<50%為AR，≥50%為阿司匹林敏感(aspirin sensitive)。根據TEG測定分為AS組(45例)和AR組(25例)，對兩組一般臨床資料比較無統計學差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

1.3 基因提取及測序

1.3.1 DNA提取 采集患者晨起空腹肘靜脈血2 ml，存放入枸櫞酸鈉抗凝管，應用DNA提取試劑盒(TIANGEN)，提取全血DNA，-20 ℃保存。

1.3.2 聚合酶鏈反應(PCR)和DNA測序 COX-1、COX-2基因變異位點的數據獲自HapMap中國漢族人群數據庫。將最小等位基因頻率(MAF)下限設為0.05，并以r2>0.8的原則從HapMap獲得的變異位點中挑選tag SNP。COX-1上-A842G引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴增長度208 bp。COX-1 C50T引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游 5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴增長度212 bp。COX-1-1676A>G引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’- GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴增長度250 bp。COX-2上-765G/C引物：上游 5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴增長度297 bp。將PCR產物送于上海生工生物工程股份有限公司進行DNA測序檢測。

2 結 果

2.1 SNP檢測結果

2.1.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 對70例患者DNA進行檢測，未發現COX-1 C50T及-A842G基因位點多態性。-1676A>G位點中，22例為AA純合子，38例為AG雜合子，10例為GG突變純合子，-1676G等位基因頻率為41.43%。COX-2基因-765G/C位點中，61例為GG純合子，9例為GC雜合子，未發現CC突變純合子，-765C等位基因頻率為6.43%。COX-1基因-1676A>G及COX-2基因的-765G/C位點等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，表明所選樣本具有群體代表性(見表2)。

2.1.2 COX-1基因-1676A>G位點及COX-2基因-765G/C位點基因型分布結果 AR組和AS組COX-1基因-1676A>G位點，其G等位基因攜帶兩組比較無統計學差異[76.0% vs 62.2%;P=0.24;OR1.92(0.64～5.76)]；COX-2基因-765G/C位點C等位基因攜帶，AR與AS組間差異無統計學意義(24.0% vs 6.7%；P=0.089;OR4.42(0.99～19.58)](見表3)。

2.2 臨床隨訪結果

2.2.1 隨訪結果 70例初發腦梗死患者規律服用阿司匹林的半年隨訪期間，共發生12例(17.14%)不良事件，其中主要終點事件8例(11.4%)，次要終點事件4例(5.7%)：包括腦出血2例(2.9%)、非致死性心肌梗死1例(1.4%)及死亡1例(1.4%)。AS組與AR組兩組終點事件發生率比較結果顯示:腦梗死復發患者AR發生率高，具有統計學差異(24.0% vs 4.4%；P=0.021)(見表4)。

2.2.2 隨訪結果與rs1330344、rs20417基因型比較 COX-2 -765G/C基因攜帶C等位基因與臨床主要終點事件腦梗死復發進行比較，差異無統計學意義[33.3% vs 8.20%;P=0.099;OR5.6(1.06～29.47)]；COX-1 -1676A>G其G等位基因攜帶與腦梗死復發無相關性[14.9% vs 4.35%;P=0.367;OR0.26(0.03～2.25)](見表5)。

表1 基線資料比較

表2 所選位點的基因型頻率分布及Hard-Weinberg平衡檢驗

表3 COX-1-1676A>G及COX-2-G765C位點基因型在AS組與AR組比較 [例數(%)]

表4 隨訪期間兩組終點事件發生率比較[例(%)]

AS：阿司匹林敏感；AR：阿司匹林抵抗*P<0.05

表5 rs1330344、rs20417基因型與臨床預后比較[例(%)]

3 討 論

本實驗共納入70例研究對象，根據TEG檢測分為AS和AR組，并進行為期半年的隨訪，研究發現AR組主要終點事件腦梗死復發(6例)較AS組升高，兩組具有統計學差異(P<0.05)，研究顯示AR與腦梗死復發相關。隨著基因技術的突破進展，從分子流行病學角度研究基因變異對心腦血管疾病的影響及其防治開辟了新的途徑。越來越多的證據表明，阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance,AR)與遺傳的基因易感性相關，在人群中篩選有關AR的易感性基因對高危人群的識別及防治具有重要意義。

AR發生的機制復雜且影響因素眾多，一些臨床相關因素如性別、吸煙、急性冠脈綜合征(ACS)、肥胖、糖尿病、腎功能不全等，可能影響患者基線狀態下血小板活性從而影響抗血小板治療反應性。本實驗進行前對AR及AS組的臨床基線資料進行比較，無統計學差異。排除了基線狀態下混雜因素對阿司匹林敏感性干擾，旨在重點探討COX-1、COX-2基因對阿司匹林療效的影響。

本研究選取了COX-1基因的3個SNP位點，包括-A842G、C50T及-1676A>G以及COX-2基因-765G/C位點。COX-1基因-A842G位點位于COX-1基因的啟動子，研究發現G等位基因(-842G)可以提供一個額外的結合位點給轉錄因子激活蛋白(AP2)啟動子區域,阻斷血小板中COX-1的表達，導致阿司匹林快速抑制COX1酶活性，增加阿司匹林敏感性[4]。它的變異可能影響COX-1的基因表達及阿司匹林的藥物療效，Ulehlova等[5]對捷克124例急性心肌梗死患者進行研究結果表明AR與COX-1-842G等位基因相關，其G等位基因的最小等位基因頻率為7.26%，而徐旭等[6]對中國心腦血管患者群進行研究發現，COX-1基因-842G與阿司匹林低反應性無明顯相關，Jalil等[7]研究表明中國、馬來西亞和印度人群均沒有COX-1基因-842G等位基因多態性。COX-1 C50T基因片段位于17位點，是調節阿司匹林治療反應程度的決定性因素，與-A842G位點呈完全連鎖不平衡，研究發現C50T基因變異在亞洲人群發生率極低，Yi等[8]研究發現中國腦梗死COX-1基因C50T等位基因雜合子僅5.8%，與AR無相關性。同樣Weng等[9]及Mukarram等[10]研究顯示C50T多態性與AR無明顯相關性，本研究選取70例進行A-842G及C50T基因測序結果顯示未發現野生雜合子及純合子型。與既往發表的文獻一致，結果顯示急性腦梗死患者阿司匹林抵抗與-A842G/C50T無相關性。

而COX-1-1676A>G基因(rs1330344)位于啟動子區，該等位基因在中國漢族人群中發生率很高。中國老年心血管疾病患者中，COX-1基因-1676A/G攜帶G等位基因 (rs1330344)變異體與阿司匹林耐藥性顯著相關。Fan等[11]對中國人群進行研究分析顯示-1676A>G其G等位基因頻率高達40%，證實攜帶G等位基因與AR相關，曹麗萍等[12]研究發現-1676A>G基因突變型與服用阿司匹林缺血性事件發生顯著相關?？赡芘cGG基因型上調COX-1 RNA及蛋白質表達增加，從而增加TXA2合成，促進血小板聚集，介導血栓形成過程。本研究結果顯示70例患者中發現GG型10例(14.2%)、AG型37例(52.9%)、AA型23例(32.9%)，其G等位基因頻率為41.43%，與漢族人種變異基因型GA+GG發生率相近，本研究發現AR組GG+AG基因型頻率達76%,高于AS組(62.2%)，但兩組無統計學差異;對70例患者進行隨訪發現主要終點事件腦梗死復發其GA+GG基因型頻率達87.5%，未復發組達64.5%，兩組無統計學差異。由于樣本量較少，尚不能驗證AR及缺血性不良事件發生與攜帶G等位基因相關。

COX-2基因位于1號染色體上，有10個外顯子，許多研究人員發現它與阿司匹林的療效有顯著的相關性[13]。阿司匹林對其抑制作用是COX-1的170倍。90%的TXA2抑制被認為是阿司匹林潛在的抗血栓活性。而位于啟動子區域的rs20417(-765G/C)與阿司匹林的應答顯著相關[14]。Sharma等[2]人在一項包括450名缺血性腦卒中患者的研究中發現，COX-2-765G/C多態性C等位基因與缺血性腦卒中患者阿司匹林耐藥性之間存在顯著相關性。另一項Yi X等[15]研究發現COX-1(rs3842787)和COX-2(rs20417)變異型相互作用與阿司匹林耐藥性顯著相關。本研究結果顯示70例患者中攜帶C等位基因突變率達12.9%，其中C等位基因攜帶在AR組為24%;在AS組為6.7%(P>0.05)。本研究顯示AR組C等位基因攜帶的頻率明顯高于AS組，對攜帶C等位基因患者主要重點事件腦梗死復發進行比較，其攜帶異位基因的終點事件發生比例較高，但兩組比較無統計學差異，可能跟研究的樣本量較少有關系。

本研究在后續研究過程中會加大樣本量，進一步驗證COX-1-1676A>G基因以及COX-2-765G/C基因是否作為腦梗死患者發生AR的易患基因，并選取其他SNP位點，進一步全面了解AR的基因變異特性，為臨床治療提供新的平臺。