1例家族性腺瘤性息肉病家系的遺傳學分析*

黃 超 閔 寒 張金坤 楊 柳 周春曉 凌 鑫 余 強&

南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室蘇州分中心1(215002)南京醫科大學附屬蘇州醫院中心實驗室2 南京醫科大學附屬蘇州醫院消化內科3蘇州市腫瘤診療中心消化內科4 蘇州市吳江區第一人民醫院消化內科5

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一種常染色體顯性遺傳病，由Bussey[1]首次發現并進行描述，其主要特征為患者結直腸存在大量腺瘤性息肉。FAP的全球發病率為1/7 000～1/10 000，具有遺傳性，息肉多于青少年時期出現，少數在幼兒時期開始生長，嬰兒時期未見息肉生長[2-3]。根據患病年齡以及結直腸內的息肉數目，FAP可分為經典型家族性腺瘤性息肉病(classical familial adenomatous polyposis, CFAP)和衰減型家族性腺瘤性息肉病(attenuated familial adenomatous polyposis, AFAP)，CFAP通常發病較早，息肉數目一般大于100枚；AFAP通常發病較晚，息肉數目少于100枚[4-5]。

隨著基因測序技術的不斷發展，FAP的發病機制越發明確，可能主要涉及腺瘤性結腸息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)基因突變。據HGMD數據庫統計，目前已發現1 400余種APC基因突變，且突變位點與表型輕重具有相關性[6]。此外，結直腸腺瘤息肉若不加以干預，則其惡變導致結直腸癌的概率接近100%[7]。因此，有長期便血、腹痛等FAP癥狀的患者應及早接受結腸鏡檢查，有助于預防結直腸癌的發生，顯著改善患者的預后和生活質量[8]。本研究通過采用新一代測序(NGS)技術對1例FAP家系進行檢測分析，旨在探討其發病原因和機制。

對象與方法

一、研究對象

先證者沈某，女，23歲，因反復便血至南京醫科大學附屬蘇州醫院就診并接受結腸鏡檢查，詢問家族史并確認家系圖(圖1)。先證者(Ⅲ7)父(Ⅱ3)母(Ⅱ4)非近親婚配，先證者與其母親、舅舅(Ⅱ5，結直腸癌已故)、表兄(Ⅲ8)均有不同程度的結直腸息肉表型，初步診斷為FAP，考慮行全結腸切除回腸直腸吻合術，術后樣本送病理切片檢查。

圖1 本例FAP患者家系圖

二、樣本采集

經先證者及其家系成員同意并簽署知情同意書后，所有研究對象于清晨就餐后抽取靜脈外周血5 mL，EDTA-K2抗凝。EDTA-K2抗凝管混勻后吸取200 μL外周血，利用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(250)(德國QIAGEN公司)提取外周血白細胞基因組DNA，Nanodrop2000c分光光度計檢測樣本DNA濃度和純度，確保DNA質量在合格范圍內(1.8

三、目標區域捕獲結合高通量測序

委托北京金準基因科技有限責任公司進行全外顯子測序。將每個樣本1.5 μg基因組DNA隨機打斷為大小為150～250 bp的片段，然后采用KAPA末端修復酶進行DNA修復，經磁珠純化后，DNA 3’端添加腺嘌呤堿基，將接頭連接至DNA片段，行文庫模板擴增。DNA文庫構建后采用SeqCap法與探針雜交，經擴增后富集至磁珠上純化并洗脫，最后行Qubit定量。取捕獲后的DNA樣本行Illumina HiSeq2500高通量測序。數據經Illumina測序控制軟件(SCS)評估合格后，讀取數據并行生物信息學分析。經BWA-0.7.12軟件比對至人類基因組參考序列(GRCh37)上，工具包去除重復序列，使用基因組分析工具包檢測單核苷酸變異和插入缺失變異，以ANNOVAR軟件對變異位點進行注釋，篩選致病突變。對可疑致病突變行Sanger測序驗證、家系共分離檢測。

結 果

一、先證者內鏡檢查和病理學結果

先證者接受結腸鏡檢查以觀察整個結直腸，結果示全結腸多發大小不等的息肉共百余枚(圖2)，以圈套電凝切除后送病理檢查，提示腺瘤性息肉為管狀腺瘤，同時伴有低級別上皮內瘤變，未發生惡變(圖3)。

圖2 先證者結腸鏡檢查結果

二、高通量測序和Sanger測序驗證結果

對先證者結直腸疾病panel基因各外顯子進行測序，其中目標區覆蓋度99.9%，目標區平均深度112.11，目標區平均深度>20×比例99.2%，經分析后未發現明確與疾病相關的大片段拷貝數變異致病的情況。APC基因第15號外顯子區域發現一處雜合突變，即c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，HGMD數據庫檢索此突變位點為已報道的致病突變，為移碼突變，對蛋白功能的影響較大。

為進一步驗證高通量測序結果，設計正向引物：5’-ACG CGG AAT TGG TCT AGG C-3’；反向引物：5’-GGT CGG CTG GGT ATT GAC C-3’，對先證者及其家系成員行Sanger測序驗證。結果顯示有結直腸息肉表型的家系成員APC基因確實存在雜合缺失突變c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，無結直腸息肉表型的成員則無此突變，與高通量測序結果一致(圖4)。且先證者APC基因的雜合突變來自于其母，其表兄存在相同的突變位點，其父和舅母此位點無突變(表1)。

討 論

FAP是一種極易導致結直腸惡性腫瘤的疾病，目前其公認的致病基因為APC基因。APC基因編碼一種作為Wnt信號通路拮抗劑的腫瘤抑制蛋白，可參與細胞遷移、黏附、轉錄激活、細胞凋亡等過程[9]。APC基因定位于染色體5q21～22，全長108 kb，共含15個外顯子，編碼2 843個氨基酸殘基，其中15號外顯子是該基因編碼區最大的外顯子，全長6 577 bp，亦是人類基因組中最大的外顯子區域，突變也多發生于15號外顯子[10-11]。APC基因突變類型以無義突變和移碼突變為主(>95%)，突變可導致終止密碼子提前出現從而形成截斷蛋白，破壞蛋白功能和結構的完整性[12]。CFAP患者中APC基因突變檢出率為80%～93%，無義突變、缺失、插入或可變剪接較為多見，大片段缺失和重復較為少見[13]；與FAP相關的突變通常聚集于突變簇區域(MCR)，突變熱點集中于密碼子213(3%)、密碼子1061(7%)、密碼子1068(2%)、密碼子1309(11%)[14-16]。

圖3 先證者腺瘤切除后病理檢查結果(HE染色，×40)

圖4 FAP家系Sanger測序驗證結果

家系成員高通量測序結果Sanger測序驗證Ⅱ3未做無突變Ⅱ4未做APC:c.2800_2803del chr5:112174091 p.T934fs雜合突變Ⅱ6未做無突變Ⅲ7APC:c.2800_2803del chr5:112174091p.T934fs雜合突變APC:c.2800_2803del chr5:112174091p.T934fs雜合突變Ⅲ8未做APC:c.2800_2803del chr5:112174091 p.T934fs雜合突變

本研究采用NGS技術檢測1例FAP家系發現，APC基因存在雜合缺失突變c.2800_2803delACTT(p.T934fs)，該突變可造成15號外顯子5’端區域4個堿基的缺失，導致發生移碼突變，形成結構異常的功能蛋白。APC蛋白包含多個功能結構區域，包括N-末端的七價重復區(密碼子6～57)、犰狳重復區(密碼子453～767)、3個15-氨基酸重復區(密碼子1020～1169)、7個20-氨基酸重復區(密碼子 1262～2033)、SAMP重復區、兩個核定位信號區(密碼子1767～1772和密碼子2048～2053)、堿性區(密碼子2200～2400)、EB1區(密碼子2560～2843)和DLG區域[17-20]。本研究中家系APC基因突變位點導致EB1蛋白功能區域發生變化并可能累及DLG區域。EB1區是EB1與MDia形成復合物的區域，有利于微管穩定性并促進細胞遷移；DLG區域可阻斷G0/G1期至S期的細胞周期，抑制細胞增殖過程，故DLG區域在控制細胞周期信號和細胞增殖中起有重要作用。由此可見，該家系中所涉及的APC基因突變位點與細胞增殖過程密切相關，該突變引起的APC蛋白變化會影響β-catenin的降解功能，使其在細胞質內過多堆積，并轉移至核內與TCF/LEF轉錄因子結合，從而激活Wnt通路下游靶基因，促進信號轉導、細胞分裂增殖從而造成較為嚴重的FAP臨床癥狀，家族成員中結直腸腺瘤發生癌變的概率也會增大。

目前臨床主要根據腺瘤病理檢查結果和內鏡下結直腸息肉數目來診斷FAP，但某些消化道息肉疾病如Peutz-Jegher綜合征、Lynch綜合征、MYH相關性息肉病、遺傳性非息肉性結腸直腸癌、幼年性息肉綜合征等[21]與FAP難以區別，給臨床診斷帶來了一定的困難，因此依靠基因測序技術進行分子診斷，可輔助臨床及早準確地進行診斷和治療。

基于Illumina平臺的NGS方法是一種與經典的Sanger鏈終止法截然不同的測序方法。其以高通量并行的模式，實現了邊合成邊測序的測序技術，當DNA鏈復制時即可追蹤標記寡核苷酸的添加。因此，NGS可產生大量DNA序列數據，與Sanger測序相比，NGS技術的數據更豐富、更完整，且Sanger測序需設計特定引物，材料重復利用率低，測序模板質量要求高，極大增加了成本[22]?；诿毠茈娪镜腟anger測序已用于人類基因組計劃，NGS技術使大規模全基因組測序變得切實可行。本研究利用NGS技術對FAP家系行全外顯子組檢測分析，耗時短、成本低、數據量足，檢測結果經Sanger測序驗證可靠。此外，先證者APC基因外顯子區域還發現多處同義突變和錯義突變(p.T1475T、p.G1660G、p.S1738S、p.V1804D、p.P1942P)，與數據庫對比發現，這些位點均為多態性位點。

在臨床診治過程中，許多FAP患者青春期即出現反復便血、腹瀉等癥狀，但多未引起重視而延誤治療。本研究中，先證者就診時結直腸已存在大量息肉樣腺瘤，必須接受手術治療。詢問家族史時發現，其家族中也有類似表型的患者，但由于年代和技術限制，并未引起重視。因此，當家族成員中有相似表型時，應考慮遺傳病的可能，及時行結腸鏡檢查，并結合基因檢測，對于攜帶突變而尚無臨床表型的家庭成員及早進行監測，以預防結直腸癌變，對于未攜帶突變的成員可按正常人群進行篩查。

綜上所述，隨著FAP臨床表型與APC基因相關性認識的深入研究和進展，臨床工作者可利用更先進的遺傳篩查技術更早、更準確地對患者進行診斷和治療，基因檢測結果與臨床決策可相輔相成。