貴州省2012-2014年流感病毒監(jiān)測(cè)情況分析

鄭勤妮　楊通華　莊麗　萬(wàn)永虎　任麗娟　付林　李世軍　唐光鵬

【摘 要】目的：分析2012-2014年貴州省流感病毒活動(dòng)規(guī)律，為貴州省的流感防控工作提供科學(xué)依據(jù)。方法：采集全省12家國(guó)家級(jí)哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例患者的鼻咽拭子。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timePCR）方法進(jìn)行檢測(cè)分析，用MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。結(jié)果：（1）RT-PCR結(jié)果對(duì)33473份流感樣病例咽拭子進(jìn)行核酸檢測(cè)，檢出陽(yáng)性標(biāo)本3783份，檢出率為11.30%，其中B型Yamagata系（BY）677份，B型Victoria系（BV）471份，B型混合型26份，A（H1N1）亞型908份，A（H3N2）亞型1690份。2012年BV和A（H3N2）同時(shí)共存，分別占總陽(yáng)性率的48.21%和49.44%。2013年BY、A（H1N1）和A（H3N2）同時(shí)共存，分別占總陽(yáng)性率的31.39%、48.91%和19.48，以A（H1N1）占優(yōu)勢(shì)。2014年以A（H3N2）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，陽(yáng)性率為65.27%。（2）MDCK細(xì)胞分離結(jié)果對(duì)1616份陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)，分離出毒株923株，分離率為57.12%。其中，BY、BV、A（H1N1）H和A（H3N2）亞型分別占13.24%、8.72%、14.36%和20.79%。結(jié)論：貴州省2012-2014年流感病毒呈交替流行，這提示應(yīng)注意基因頻繁交替變異新毒株的出現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】流感病毒;監(jiān)測(cè);MDCK細(xì)胞;RT-PCR

【中圖分類號(hào)】R373.13【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783（2019）12-03--01

流行性感冒病毒（influence virus）簡(jiǎn)稱流感病毒，可引起急性呼吸道傳染病-流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）。流感為第一個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的傳染病，同時(shí)也是至今無(wú)法完全加以控制的一種病毒性急性呼吸道傳染病[1]。流感病毒屬于正粘病毒科，為單股、負(fù)鏈、分節(jié)段RNA病毒，分為甲（A）、乙（B）和丙（C）三型。流感病毒表面抗原HA和NA容易發(fā)生變異，導(dǎo)致每年季節(jié)性流感和偶爾流感大流行的發(fā)生，在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致一定的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)[2-4]，流感并發(fā)癥可引起年老體弱者一定的死亡率[2，5，6]。1957年2月貴州省首發(fā)甲2（H2N2）亞型流感病毒，被稱之為亞洲流感病毒[7]，為了更好地了解貴州省流感病毒活動(dòng)的特征，本文對(duì)2012-2014年間貴州省流感病毒的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源

標(biāo)本來(lái)自貴州省9個(gè)市（州）疾病預(yù)防控制中心流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室及12家哨點(diǎn)醫(yī)院。依據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》在哨點(diǎn)醫(yī)院呼吸內(nèi)科、兒科、急診科采集發(fā)熱3d或3d之內(nèi)未服用抗病毒藥物的流感樣病例患者的鼻咽拭子，采集對(duì)象為發(fā)熱、腋下體溫≥38℃，伴有咳嗽或咽喉疼痛之一。

1.1.2 MDCK細(xì)胞系 MDCK細(xì)胞均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所提供。

1.1.3 主要試劑 改良的1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺）（CatNo.11965）;青、鏈霉素母液（10000U/mL青霉素G;10000?g/mL硫酸鏈霉素，CatNo.SV30010）;TPCK-胰酶（牛胰腺來(lái)源Ⅷ型）;胎牛血清（CatNo.16000）均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na，CatNo.25300）;Hepes緩沖液，1M母液 （CatNo.SH30237.01）;0.75%牛血清白蛋白組分V（CatNo.RS0007）;Na2HCO3（CatNo.SH30033.01）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;1M的PBS液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，1.5%豚鼠血，核酸提取試劑盒。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡（EVOS）購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司;熒光定量PCR儀（ABI7500）購(gòu)自美國(guó)ABI公司;低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司;4℃冰箱和-80℃超低溫冰箱購(gòu)自中國(guó)青島Haier公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的處理 所采集的標(biāo)本經(jīng)震蕩20min混均后，吸取200ul樣品進(jìn)行病毒核酸的提取，剩余的樣品中加入5%的雙抗4℃處理4小時(shí)或者過(guò)夜，以備MDCK細(xì)胞分離用。

1.2.2 MDCK細(xì)胞培養(yǎng) 參照全國(guó)流感方案操作。

1.2.3 病毒核酸提取 提取試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司的The RNeasy Mini Kit（50），具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 Real-Time PCR擴(kuò)增 （達(dá)安試劑盒），具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 病毒分離培養(yǎng) 吸取1mL經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的雙抗處理好的標(biāo)本，接種到生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)均良好的MDCK細(xì)胞單層上，于35℃孵育1.5h，棄去標(biāo)本液，PBS洗細(xì)胞兩遍，加入5mL病毒生長(zhǎng)液，于35℃培養(yǎng)，24h時(shí)開(kāi)始每日觀察細(xì)胞病變，24h內(nèi)病變的細(xì)胞屬非特異性病變，達(dá)到90-100%的細(xì)胞脫落時(shí)收獲病毒培養(yǎng)液。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR監(jiān)測(cè)結(jié)果

2012-2014年貴州省共檢測(cè)流感樣病例標(biāo)本33473份，RT-PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性3783份，陽(yáng)性率為11.30%。其中，BY 亞型677份，占17.90%，BV亞型471份，占12.54%，混合型23份，占0.69%，A（H1N1）亞型908份，占24.00%，A（H3N2）亞型483份，占44.67%。2012年共檢測(cè)標(biāo)本數(shù)為6829份，檢出核酸陽(yáng)性977份，陽(yáng)性率為14.31%。其中，BV和A（H3N2）亞型分別為471、483份， 占48.21%和49.44%，為兩種病毒同時(shí)共存，并檢出23份混合毒株。2013年共檢測(cè)標(biāo)本數(shù)為12138份，檢出核酸陽(yáng)性1335份，陽(yáng)性率為11%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亞型分別為419、653和260份， 占31.39%、48.91%和19.48%，為三種病毒共存，其中A（H1N1）占優(yōu)勢(shì)毒株，檢測(cè)到3株混合型。2014年共檢測(cè)標(biāo)本數(shù)為14506份，檢出核酸陽(yáng)性1451份，陽(yáng)性率為10%。BY、A（H1N1）和A（H3N2）亞型共存，A（H3N2）亞型947份，占65.27%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)毒株。

2.2 流感病毒MDCK細(xì)胞分離結(jié)果 2012-2014年貴州省共檢測(cè)核酸陽(yáng)性標(biāo)本3853份，對(duì)1616份標(biāo)本進(jìn)行了流感病毒的分離培養(yǎng)（由各個(gè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離），分離到流感病毒923株，分離率為57.12%，其中214株BY亞型，141株BV亞型，232株A（H1N1）亞型，336株（AH3N2）亞型。2012年分離BV亞型毒株141株，分離率為20.17%，成為主要毒株。2013年分離BY和A（H1N1）亞型毒株分別為154、174株，分離率為33.45%和38.93%。2014年分離A（H3N3）亞型毒株261株，分離率為55.53%。

3 討論

流感病毒的變異與流感的暴發(fā)和流行密切相關(guān)，流感病毒正是通過(guò)不斷改變其抗原性來(lái)逃逸宿主的特異性免疫識(shí)別和清除，從而引起流行[8]。2012-2014年貴州省流感病毒監(jiān)測(cè)核酸結(jié)果提示，貴州省在這三年間檢出BY、BV、A（H1N1） 和A（H3N2）流感病毒，這與全國(guó)流感監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。2012年 BV和A（H3N2）亞型分別占陽(yáng)性率的48.21%和49.44%，為兩種病毒同時(shí)共存，BV占48.21%的陽(yáng)性率，呈現(xiàn)一個(gè)流行高峰，這與2011年B型流感病毒在我國(guó)局部地區(qū)小規(guī)模的爆發(fā)相符[8]。2013-2014年BV消失，且2013年A（H3N2）亞型的檢出率下降，這可能與流行高峰后人們對(duì)流感病毒有一定的免疫力有關(guān)。相反2013年BY和A （H1N1）的檢出率升高，分別占陽(yáng)性率的31.39%和48.91%，這可能與流感病毒通過(guò)不斷改變抗原性來(lái)逃脫宿主的免疫有關(guān)[7]。2014年A（H3N2）亞型流感病毒又呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢(shì)，2014年檢出A（H3N2）亞型流感病毒947份，占陽(yáng)性率的65.27%，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)毒株。由此表明，2012-2014年間，貴州省流感病毒的流行特征為各亞型毒株交替出現(xiàn)。其中值得注意的是A（H3N2）亞型流感病毒在這三年間均與其余亞型共存，2012和2014年均以優(yōu)勢(shì)毒株出現(xiàn)，這就提示我們?cè)诰枇鞲胁《净蝾l繁變異下新毒株出現(xiàn)的同時(shí)，還應(yīng)注重A（H3N2）亞型流感病毒的防控。

組織細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒是流感實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。該方法不受流感病毒株抗原變化影響，能監(jiān)測(cè)新的流行的流感病毒亞型出現(xiàn)，為新一代流感疫苗的制備提供依據(jù)。流感病毒組織細(xì)胞分離陽(yáng)性率與實(shí)驗(yàn)室能力、流感病毒流行強(qiáng)度、病毒型別和接種標(biāo)本盲傳代次有關(guān)，2012-2014年貴州省流感病毒細(xì)胞分離陽(yáng)性率與核酸檢測(cè)陽(yáng)性率相符。RT-PCR核酸檢測(cè)和細(xì)胞分離結(jié)果顯示，2012年細(xì)胞分離BV系141株，占20.17%。這與2011年BV流行有關(guān)，而A（H3N2）分離率低，可能與實(shí)驗(yàn)室能力有關(guān)。2013年細(xì)胞分離BY系154株，占33.45%，A（H1N1）亞型174株，占38.93%，這與核酸檢測(cè)的結(jié)果相符。2014年細(xì)胞分離A（H3N2）亞型265株，占55.53%，與核酸檢測(cè)結(jié)果相符合。2012-2014年間細(xì)胞分離毒株數(shù)與上毒陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)呈反相關(guān)，這可能主要與實(shí)驗(yàn)室能力和接種標(biāo)本盲傳代次有關(guān)。細(xì)胞分離方法是用于流感病毒的分離、培養(yǎng)的常規(guī)方法。因此，穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)隊(duì)伍，加強(qiáng)質(zhì)量控制，規(guī)范操作和增加標(biāo)本盲傳代數(shù)是提高細(xì)胞分離流感病毒的保障。

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