胰島素樣生長因子-Ⅱ對卵巢癌細胞SKOV3中MMP-9表達的調節及其機制分析

楊杰

【摘 要】目的：分析胰島素樣生長因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）對卵巢癌細胞SKOV3中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達的影響。方法：持續培養細胞48h后加入不同濃度IGF-Ⅱ，繼續培養18h，然后應用RT-PCR法行MMP-9mRNA測定，應用明膠酶譜法對MMP-9蛋白水平變化情況進行半定量測定。結果：IGF-Ⅱ能夠對MMP-9蛋白分泌產生刺激作用，IGF-Ⅱ濃度不斷增加的情況下其誘導作用也隨之增強，隨著濃度升高，MMP-9分泌量出現下降表現，但是IGF-Ⅱ對MMP-9基因表達水平不會產生明顯影響。結論：IGF-Ⅱ能夠對卵巢癌細胞SKOV3中MMP-9分泌產生刺激作用，在卵巢癌侵襲及轉移等過程中也可發揮一定的作用。

【關鍵詞】胰島素樣生長因子-Ⅱ;卵巢癌細胞SKOV3;MMP-9表達的調節及其機制

【中圖分類號】R737.31【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2019）12-03--02

基質金屬蛋白酶為Ca2+及Zn2+依賴酶家族，明膠酶表達與卵巢癌侵襲及轉移存在重要關聯。特異性金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）可有效阻斷明膠酶活性，腫瘤惡性表型可能與TIMPs、MMP-S及MMP-9等動態平衡失調可能存在重要關聯[1]。此次研究旨在分析IGF-Ⅱ對卵巢癌細胞SKOV3中MMP-9表達的影響，如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于含10%小牛血清的RPMI1640培養基中對SKOV3腫瘤細胞株進行常規培養，TIMP-1、MMP-9及β-catin引物由上海生物工程公司合成，PCR試劑盒產自SABC公司，AMV反轉錄盒產自Peptotech公司，IGF-Ⅱ產自Peptotech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

應用0.25%胰酶消化對數生長期卵巢癌細胞SKOV3中，在24孔板中接種1.5×105/ml濃度細胞懸液，1ml培養基/孔，每組均有4個復孔。在37℃環境下持續培育（48h），然后將上清棄除，應用無血清培養基進行清洗，然后將不含IGF-Ⅱ、含有10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml等不同濃度的IGF-Ⅱ加入其中，繼續培養18h。收集細胞后將細胞總RNA提出出來并保存至-80℃冰箱內。收集細胞無血清培養上清液并通過離心處理將細胞碎片去除，然后放置于-20℃環境下保存[2]。

1.2.2 明膠酶譜法

分別配制5%濃縮膠及10%分離膠，將終濃度0.1%明膠加入分離膠中，陽性對照為HT-1080細胞上清液。應用細胞計數法對細胞培養上清液中的等總蛋白樣品進行調整，然后將之置于樣品槽中電泳，將2.5% TritonX-100溶液中加入凝膠并漂洗2次。在37℃恒溫搖床及100ml明膠酶緩沖液中持續溫育12-16h，采用0.1%考馬斯亮藍染色后再實施脫色處理，對負染酶帶進行觀察[3]。

1.2.3 RT-PCR法

待IGF-Ⅱ作用于細胞后應用異硫氰酸胍一步法實施總RNA提取操作，應用AMV反轉錄酶反轉錄總RNA，內參照為β-actin。

1.3 統計學分析

每組試驗重復進行3次，應用Gel-analysis凝膠成像系統對試驗結果進行分析，應用單因素方法分析法進行統計，P<0.05組間差異顯著且有統計學意義。

2 結果

2.1 IGF-Ⅱ調節SKOV3培養上清液中MMP-9蛋白分泌情況分析

研究結果表明，10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml IGF-Ⅱ均能夠使MMP-9表達得到增加，將不含IGF-Ⅱ的SKOV3培養液作為對比組并將MMP-9含量作為1，不同濃度下IGF-ⅡMMP-9增加比例為（47.79±2.51）%、（80.16±2.49）%、（75.01±4.19）%，與對比組相比可見顯著差異，P<0.05。

2.2 IGF-Ⅱ對MMP-9表達影響分析

IGF-Ⅱ刺激細胞18h后進行細胞總RNA提取并進行反轉錄后，應用PCP擴增TIMP-1m RNA及MMP-9mRNA。不含IGF-Ⅱ刺激SKOV3后的MMP-9mRNA與β-actin mRNA比值為1.4871±0.0414，10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml不同濃度時比值分別為1.4901±0.0398、1.5049±0.0135、15154±0.0141，差異無統計學意義，P>0.05。

3 討論

作為促有絲分裂原，IGF-Ⅱ可通過酪氨酸激酶途徑加快腫瘤細胞轉化及增殖。此次研究表明，不同濃度IGF-Ⅱ對MMP-9mRNA基因表達誘導作用不明顯，IGF-Ⅱ不會導致MMP-9基因表達增加，表明IGF-Ⅱ對卵巢癌細胞SKOV3MMPs表達不會產生促進作用，IGF-Ⅱ可通過轉錄后蛋白調節增加卵巢癌細胞MMP-9分泌量[4]。綜上所述，IGF-Ⅱ可刺激卵巢癌細胞SKOV3中MMP-9分泌，可促進卵巢癌腫瘤侵襲及轉移。

參考文獻：

田甜，梁霞，韓翠欣，陳詠梅，等.妊娠期高血壓病患者胎盤組織中IGF-Ⅱ、IGFB P-1和抵抗素的表達及相關性分析[J].中國臨床醫學，2019，26（3）：477-481.

閆林萍，烏蘭，鐘天鷹，劉嵐.胎盤長鏈非編碼RNA CTD-2012K14.6異常表達致胎兒巨大的初步功能研究[J].中華內分泌代謝雜志，2019，35（2）：138-142.

李輝，劉麗偉.外周血IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ水平及組織ER表達情況及與子宮肌瘤的相關性研究[J].實驗與檢驗醫學，2019，37（1）：44-47.

寧佩芳，高玉華，劉君，李奕.卵巢癌中IGF-Ⅱ、IGFBP-3的表達及其與臨床病理特征的相關性研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2017，16（1）：26-29.