雞BCO2基因功能性單核苷酸多態性的生物 信息分析

郝文文 楊倩倩 張貝 張健 張傳生 耿立英 李祥龍

摘? 要：旨在篩選雞BCO2基因中具有潛在生物學功能的同義單核苷酸多態性（non-synonymous single nucleotide polymorphisms，nsSNPs）。從SNP數據庫中檢索出8個BCO2 基因nsSNPs，利用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEAN方法分析引起的氨基酸替換是否可能影響BCO2 的功能預測。進一步對雞BCO2基因編碼的氨基酸序列進行翻譯后修飾位點預測以及進化位點保守性預測;使用SWISS-MODEL構建了BCO2野生型以及突變型蛋白質的空間結構。結果表明：3個nsSNPs（rs739117331、rs735703078和rs736211538）可能嚴重影響BCO2蛋白功能。

關鍵詞：雞;BCO2基因;非同義SNP;SNP功能預測;蛋白質高級結構構建中圖分類號：S831? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）04-0017-05

非同義單核苷酸多態性（nsSNPs）是指處于編碼區可引起氨基酸序列變化的單核苷酸突變，因其可能會對蛋白質功能造成影響，多被認為是導致畜禽表型變異的重要原因[1，2]。利用生物信息學方法對未知表型的nsSNP進行功能性預測，是一種篩選候選功能位點的理想策略，目前已有諸多成功的研究報道[3-6]。BCO2基因（Beta-carotene 9′，10′-monooxygenase，BCO2）編碼的β-胡蘿卜素加氧酶2在動物體內類胡蘿卜素的代謝過程中起著至關重要的作用[7]。雞皮膚表現出黃色主要是由于表皮層類胡蘿卜素沉積的結果，類胡蘿卜素被降解，雞皮膚呈現白色。研究發現，雞BCO2基因的一個G/A突變位點（chr24：6268434bp）與黃皮膚性狀存在著連鎖關系，且該基因在黃色皮膚組織中的表達量顯著低于白色皮膚組織[8]。還發現，在綿羊、家兔等動物的黃脂肪性狀也與BCO2基因編碼區的突變有關[9-11]，這提示BCO2基因突變可以造成它介導類胡蘿卜素降解的功能發生改變。本研究對利用生物信息技術對雞BCO2基因編碼區nsSNPs進行分析，篩選其中候選功能性錯義突變位點，為后續的表型關聯分析和雞皮膚顏色的分子遺傳育種提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? BCO2基因nsSNPs的搜集? 以BCO2基因的序列號（ENSGALG00000007868）從Ensembl genome browser（http：//asia.ensembl.org）中進行檢索，確定各SNPs在基因中的位置（外顯子區、內含子區、啟動子區域等），篩選出位于編碼區的nsSNPs。

1.2? NsSNPs對BCO2基因功能的影響? 應用4種預測方法SIFT（http：//blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html）[12]、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2）[13]、PANTHER（http：//pantherdb.org/tools/csnpScoreForm.jsp）[14]和PROVEN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）[15]軟件分析各nsSNP對進行BCO2蛋白功能的影響。

1.3? 進化保守位點分析? 利用在線服務器ConSurf（http：//consurftest.tau.ac.il）[16]分析BCO2蛋白氨基酸位點的進化保守水平。越保守位點發生變異越可能造成功能或結構上的影響。

1.4? 翻譯后修飾位點預測? 分別利用BDM-PUB（http：//bdmpub.biocuckoo.org/）和NetPhos 2.0（http：//gps.biocuckoo.org/）[17]在線軟件預測BCO2蛋白質氨基酸泛素化修飾位點和預測磷酸化修飾位點。

1.5? 蛋白質穩定性分析? 利用I-Mutant 2.0（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/I-Mutant2.0/I-Mutant2.0.cgi）[18]在線軟件評估nsSNP引起的蛋白質穩定性的改變。在評估結果中，DDG為自由能變化值，DDG<0表示此nsSNP降低了蛋白質的穩定性，DDG>0表示此nsSNP增加了蛋白質的穩定性，-0.05≤DDG≤0.05表示蛋白質的穩定性變化為中性。RI（Reliability Index）為可靠性指數，范圍在0～10。

2? 結果與分析

2.1? 雞BCO2基因nsSNPs的篩選結果? 從SNP數據庫中共檢索到BCO2基因兩個轉錄子：

BCO2-201（ENSGALT00000043097）;

BCO2-202（ENSGALT00000012775）。

8個nsSNPs，具體結果見表1。

2.2? 雞BCO2基因有害nsSNPs預測結果? 采用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEN四種方法在BCO2-201分別預測到4個、5個、3個和3個有害突變，在BCO2-202分別預測到4個、4個、3個和3個有害突變。其中rs736211538、rs735703078在兩個轉錄子、BCO2-201的rs739117331和BCO2-201的rs736989374均至少三種方法預測為有害位點。

2.3? 進化保守位點分析? 利用在線服務器ConSurf預測BCO2基因的進化保守位點，分數在7～9之間的位點為進化保守性位點。如表2所示，在BCO2編碼的多肽鏈氨基酸序列中，與多態位點一致的保守性位點共有3個，分別為rs739117331、rs735703078和rs736211538，這3個位點的多態性更容易對蛋白質結構或功能造成影響。

2.4? 翻譯后修飾位點預測? 本研究利用BDM-PUB在線軟件預測泛素化修飾位點，利用NetPhos 2.0預測磷酸化修飾位點（表3）。結果，與BCO2蛋白多態位點一致的泛素化修飾位點為K416，磷酸化修飾位點為S535。

2.5? 蛋白質穩定性分析? 利用I-Mutant2.0評估nsSNP引起的蛋白質穩定性的影響（見表4），可見BCO2-202中除D510E和K416N使蛋白質穩定性升高，其他位點多態性均使得蛋白質穩定性下降;BCO2-201中除D354A和K260N使蛋白質穩定性升高，其他位點多態性均使得蛋白質穩定性下降。

2.6? 蛋白質高級結構建模? 利用在線建模服務器SWISS-MODEL為雞BCO2-201和BCO2-202兩個轉錄子蛋白質突變體建模，并利用軟件PyMOL將功能性錯義突變分別定位到BCO2-201（圖1A）和BCO2-202（圖1B）蛋白質高級結構。

3? 討論與結論

本研究通過蛋白質的結構和功能特性這個角度驗證雞的BCO2基因編碼區中的nsSNPs是否有害。首先，從Ensembl檢索到BCO2基因編碼區8個nsSNPs，并用四款軟件對其進行功能預測，初步篩選出候選的有害nsSNPs;同時，本研究又從蛋白質翻譯后修飾以及氨基酸位點進化保守水平的角度對候選nsSNPs潛在生物學功能進行評估。在發現的8個nsSNPs中，其中D371A被4個方法均預測為有害突變;進化保守性預測結果也顯示D371屬于高度保守，這意味著該位點對BCO2功能正常發揮十分重要。因此D371A在BCO2所有的nsSNPs中危害最大，相應的多態位點為功能性位點。另外，位點S535A為磷酸化修飾位點，它可破壞影響蛋白質之間的信號傳導致使蛋白質功能不能正常發揮，加之有3個方法均預測S535A為有害突變，同時S535還是保守性位點，所以S535A為第2個功能位點。第3個候選功能位點為T331P，該位點也被3個nsSNPs功能預測軟件預測為有害突變，且該位點也是進化保守性位點，因此不可忽視該突變對BCO2蛋白質功能的影響;最后，雖然K416為泛素化修飾位點，該位點突變可能通過影響蛋白質合成后的泛素化過程，破致使蛋白質功能不能正常發揮，但4種軟件對K416N的預測結果均為中性，因此該突變有待進一步研究。

參考文獻：

[1]? Cao，R.，et al.，dbSAP：single amino-acid polymorphism database for protein variation detection[J].Nucleic Acids Res， 2017，45（D1）： D827-D832.

[2]? Katsonis， P.， et al.， Single nucleotide variations： biological impact and theoretical interpretation[J].Protein Sci， 2014，23（12）： 1650-66.

[3]? Kelly， J.N. and S.D. Barr， In silico analysis of functional single nucleotide polymorphisms in the human TRIM22 gene[J].PLoS One，2014，9（7）： e101436.

[4]? Rebai， M. and A. Rebai， In silico characterization of functional SNP within the oestrogen receptor gene[J].J Genet， 2016，95（4）： 865-874.

[5]? Saleh， M.A.， et al.， Impacts of Nonsynonymous Single Nucleotide Polymorphisms of Adiponectin Receptor 1 Gene on Corresponding Protein Stability： A Computational Approach[J].Biomed Res Int，2016，2016： 9142190.

[6]? Singh， R.K. and K. Mahalingam， In silico approach to identify non-synonymous SNPs in human obesity related gene，MC3R （melanocortin-3-receptor）[J].Comput Biol Chem，2017，67：122-130.

[7]? Wu， L.， et al.， Molecular aspects of beta， beta-carotene-9'，10'-oxygenase 2 in carotenoid metabolism and diseases[J].Exp Biol Med （Maywood）， 2016，241（17）：1879-1887.

[8]? Eriksson， J.， et al.， Identification of the yellow skin gene reveals a hybrid origin of the domestic chicken[J].PLoS Genet，2008，4（2）：e1000010.

[9]? Strychalski，J.，et al.，A novel AAT-deletion mutation in the coding sequence of the BCO2 gene in yellow-fat rabbits[J].J Appl Genet，2015，56（4）： 535-537.

[10]? Niu， Y.， et al.， Biallelic beta-carotene oxygenase 2 knockout results in yellow fat in sheep via CRISPR/Cas9[J].Anim Genet，2017，48（2）：242-244.

[11]? Vage， D.I. and I.A. Boman， A nonsense mutation in the beta-carotene oxygenase 2（BCO2）gene is tightly associated with accumulation of carotenoids in adipose tissue in sheep （Ovis aries）[J].BMC Genet， 2010，11：10.

[12]? Kumar， P.， S. Henikoff， and P.C. Ng， Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm[J].Nat Protoc， 2009，4（7）：1073-81.

[13]? Adzhubei， I.A.， et al.， A method and server for predicting damaging missense mutations[J].Nat Methods，2010，7（4）：248-249.

[14]? Tang， H. and P.D. Thomas， PANTHER-PSEP： predicting disease-causing genetic variants using position-specific evolutionary preservation[J].Bioinformatics，2016，32（14）：2230-2232.

[15]? Choi， Y. and A.P. Chan， PROVEAN web server： a tool to predict the functional effect of amino acid substitutions and indels[J].Bioinformatics， 2015，31（16）： 2745-2747.

[16]? Ashkenazy， H.， et al.， ConSurf 2016： an improved methodology to estimate and visualize evolutionary conservation in macromolecules[J].Nucleic Acids Res， 2016，44（W1）： W344-350.

[17]? Xue， Y.， et al.， GPS 2.1：enhanced prediction of kinase-specific phosphorylation sites with an algorithm of motif length selection[J].Protein Eng Des Sel，2011，24（3）：255-260.

[18]? Capriotti， E.， P.Fariselli， and R. Casadio， I-Mutant2.0：predicting stability changes upon mutation from the protein sequence or structure[J].Nucleic Acids Res，2005，33（Web Server issue）： 306-310.收稿日期：2019-03-22

基金項目：河北省教育廳重點項目（項目編號：ZD2018225），河北科技師范學院博士啟動基金（項目編號：2018YB002），河北省現代農業產業技術體系蛋雞產業創新團隊崗位項目（項目編號：HBCT2013090206）。

作者簡介：郝文文（1996-），女，研究生在讀，研究方向為家禽遺傳育種，E-mail：794911295@qq.com。

通訊作者：張傳生（1976-），男，寧陽縣人，教授，主要從事動物遺傳育種的研究。E-mail：cszhang1976@126.com。