白芥子涂方乳化型膏貼劑的制備工藝

劉新國，黃文濤

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

白芥子涂方用于防治肺系疾病，始見于清代張璐編撰的《張氏醫通》，該方在防治哮喘方面有較好療效，目前被各大醫院廣泛采用[1]。傳統白芥子涂方以藥材粉末入藥，不僅成分含量不可控，且由于藥材本身質量差異以及患者皮膚耐受程度差別，使得貼敷時間一般只能維持2～6 h[2-3]，有悖于經皮給藥制劑質量可控、緩釋長效的要求。目前，筆者尚未見基于該方開發的現代膏貼劑型。筆者在系統比較軟膏劑、黑膏藥等膏貼劑型特點基礎上，配制具有乳化性質的硬膏劑基質。該基質與其他外用膏貼基質相比，在載藥量、乳化性能、藥物兼容性、透皮能力、穩定性方面均具有明顯優勢。筆者在研究中首先采用乙醇回流提取與現代超臨界二氧化碳(CO2)萃取技術實現藥材有效成分的濃度富集與純化，再結合乳化型膏貼透皮劑型，將此傳統經典方藥開發成治療哮喘的新型中藥膏貼劑型，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SPD-10A型二元泵高效液相色譜儀，配Essentia SPD-16型紫外檢測器(島津公司)； ME215s型分析天平(Sartorious公司，感量：0.01 mg)；HS6510D型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 芥子堿硫氰酸鹽對照品(批號：111702-201303，含量：98.3%)、大戟二烯醇對照品(批號：111866-201302，含量：99.9%)、細辛酯素對照品(批號：111889-201203，含量：100%)、延胡索乙素對照品(批號：0726-200208，含量：99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(美國Tedia試劑公司生產，批號：16095012)。水為純凈水，其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件

2.1.1芥子堿硫氰酸鹽含量測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.08 mol·L-1磷酸二氫鉀(10：90)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：326 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論塔板數按芥子堿峰計算應不低于3000。

2.1.2大戟二烯醇含量測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(95：5)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數按大戟二烯醇峰計算應不低于6000。

2.1.3細辛脂素測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%醋酸溶液(48：52)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：287 nm；進樣量：10 μL；柱溫：室溫，理論板數按細辛脂素峰計算應不低于3000[4]。

2.1.4延胡索乙素測定色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(40：60)，用三乙胺調pH值6.5；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數按延胡索乙素峰計算應不低于3000[5]。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品貯備溶液的制備 精密稱取經五氧化二磷干燥至恒重的芥子堿硫氰酸鹽對照品、大戟二烯醇對照品各適量，分別置于不同量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成芥子堿硫氰酸鹽496 μg·mL-1和大戟二烯醇163 μg·mL-1對照品貯備溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取各回流提取樣品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備 取除受試藥材以外的藥材，按回流提取方法操作，精密量取提取液樣品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即為陰性對照溶液。

2.3方法學考察

2.3.1方法專屬性考察 吸取供試品溶液、陰性對照溶液、芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇對照品溶液各10 μL，按“2.1”項色譜條件進行液相分析，見圖1。

2.3.2標準曲線的繪制 精密量取上述對照品貯備溶液100，200，400，1000，2000 μL，加甲醇稀釋定容至10 mL，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件平行進樣測定3次。以芥子堿硫氰酸鹽、大戟二烯醇進樣量(ng)為橫坐標(X)，峰面積平均值為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

2.3.3精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.1”項色譜條件連續進樣5次，測得芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇峰面積的RSD分別為0.28%和0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，6，12 h進樣測定。經計算，芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇峰面積的RSD分別為1.12%和1.57%，表明供試品溶液在12 h內基本保持穩定。

2.3.5回收率實驗 精密稱取9份已知含量的回流提取液200 μL，分別向其中加入一定量芥子堿硫氰酸鹽或大戟二烯醇對照品，用流動相加至5 mL，混勻，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。利用標準曲線計算含量，以3次平行進樣的平均含量計算加樣回收率，結果芥子堿硫氰酸鹽平均回收率97.06%，RSD=2.40%，大戟二烯醇平均回收費率96.66%，RSD=2.31%。見表2。

2.4白芥子、甘遂回流提取工藝的正交實驗設計 白芥子、甘遂藥材乙醇回流提取工藝，以白芥子有效成分芥子堿硫氰酸鹽和甘遂有效成分大戟二烯醇的提取量作為考察指標，采用《中華人民共和國藥典》2015年版芥子和甘遂藥材品種項下高效液相色譜(HPLC)法測定相關指標成分含量[5]。以乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數為影響因素，選用L9(34)表進行正交實驗，優選回流提取工藝條件。正交實驗因素水平設計見表3。

A.芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺芥子的陰性對照品溶液；D.大戟二烯醇對照品溶液；E.供試品溶液；F.缺甘遂的陰性對照品溶液；1.芥子堿硫氰酸鹽；2.大戟二烯醇

圖1 回流提取樣品的高效液相色譜圖

A.sinapine thiocyanate；B.sample solution; C.mustard negative control; D.euphadienol; E.sample solution;F.euphorbia negative control；1.sinapine thiocyanate control；2.euphadienol

Fig.1Highperformanceliquidchromatographforrefluxingsamples

表1 芥子堿硫氰酸鹽與大戟二烯醇線性關系考察

Tab.1Linearcorrelationofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分線性方程r線性范圍/ng芥子堿硫氰酸鹽Y=7534.6X-25 9880.999 849.2～992大戟二烯醇Y=37 652X-22 3970.999 916.3～326

表2 芥子堿硫氰酸鹽與大戟二烯醇回收率實驗結果

Tab.2Experimentalresultsontherecoveryofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分樣品量加入量測得量μg回收率/%芥子堿硫氰酸鹽97.874.4166.392.0797.874.4168.795.3097.874.4168.194.4997.899.2195.498.3997.899.2194.497.3897.899.2193.696.5797.8124.0220.298.7197.8124.0219.197.8297.8124.0220.899.19大戟二烯醇24.916.340.394.4824.916.340.796.9324.916.340.998.1624.924.547.692.6524.924.548.696.7324.924.549.299.1824.932.657.198.7724.932.657.399.3924.932.656.697.24

表3 回流提取工藝正交實驗因素水平

Tab.3Factorsandlevelsoforthogonalexperimentforrefluxextractionprocess

水平乙醇濃度(A)/%提取時間(B)/min溶劑用量(C)/mV提取次數(D)16060 17127590 1102390120 1133

2.5細辛和延胡索超臨界CO2萃取工藝正交實驗設計 細辛和延胡索超臨界CO2萃取工藝是以延胡索中延胡索乙素以及細辛中細辛酯素提取量為考察指標，采用《中華人民共和國藥典》2015年版細辛和延胡索藥材品種項下HPLC法測定相關指標成分含量[5]。以萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑用量、萃取時間為影響因素，選用L9(34)表進行正交實驗，優選超臨界CO2萃取工藝條件。正交實驗因素水平設計見表4。

表4 超臨界CO2萃取工藝正交實驗因素水平表

Tab.4FactorsandlevelsoforthogonalexperimentforsupercriticalCO2extractionprocess

水平萃取壓力(A)/MPa萃取溫度(B)/℃夾帶劑用量(C)/倍萃取時間(D)/min115401.560225503.090335604.5120

2.6乳化型膏貼基質配方的正交實驗設計 成型工藝采用石蠟、單甘酯、凡士林、甘油為中藥膏貼劑型基質配料，選擇黏性、軟硬度、熔化性、均勻度等為考察指標進行綜合評分，采用L9(34)正交實驗優選基質配制比例，正交實驗因素水平設計見表5。

表5 基質配比正交實驗設計表

Tab.5Orthogonaldesignofmatrixratio

g

按膏貼基質配比正交實驗設計表實驗，將制成的藥膏制成圓柱狀，再切成圓片狀，將藥膏填充入背襯層的固定圓環中，使每張膏貼中填充藥膏2 g，直徑約3.6 cm，含生藥材4 g。以下是正交實驗基質評分的標準。①黏性。4分：適中，不粘手；2分：黏性偏強或偏差；0分：無黏性或粘手。②軟硬度。4分：適中，易成形，易壓成片狀；2分：較易成形，但偏硬或偏軟；0分：太硬或太軟，不易成形。③均勻度(肉眼觀察)。4分：顏色均勻一致；2分：比較均勻，但浸膏與基質混合略顯不均勻；0分：浸膏與基質混合不均勻。④熔化性(45～50 ℃考察48 h)。4分：制成貼劑后，放置恒溫45～50 ℃烘箱中觀察48 h，基質不熔化，底襯墊上未見明顯熔化痕跡<1 mm；2分：基質少量熔化，底襯墊上熔化痕跡1～2.5 mm；0分：基質熔化明顯，底襯墊上熔化痕跡>2.5 mm。⑤載藥量。4分：20%以上；3分：15～20%；2分：10～15%；1分：10%以下。

2.7白芥子和甘遂回流提取的正交實驗結果 按表1設計方案分別進行回流提取，濾過，測定其中芥子堿硫氰酸鹽和大戟二烯醇含量，正交實驗結果見表6，各指標成分方差分析結果見表7，8。

結果顯示，僅乙醇濃度對白芥子和甘遂提取效果產生顯著影響(P<0.05)，高濃度乙醇不利于芥子堿溶出。而對于甘遂的提取而言，溶劑用量是影響結果的首要因素(P<0.05)，適當提高乙醇濃度可以增加大戟二烯醇的溶出。如果考慮將兩種藥材進行合并提取，綜合省時、經濟方面的因素考慮，則應選擇乙醇回流提取工藝條件為加13倍量60%乙醇，回流提取1次，每次1 h。

2.8細辛和延胡索超臨界CO2萃取正交實驗結果 按表2設計方案分別進行超臨界CO2萃取，測定樣品中細辛脂素和延胡索乙素含量，正交實驗結果見表9，各指標成分方差分析結果分別見表10，11。

表6 白芥子和甘遂乙醇回流提取正交實驗結果

Tab.6Orthogonalexperimentresultsofethanolrefluxextractionofwhitemustardseedandeuphorbia

序號因素石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)芥子堿硫氰酸鹽大戟二烯醇(μg·mL-1)11111543.1120.021222488.8124.431333489.6128.842123484.7150.752231471.4153.662312448.1146.573132424.3143.583213410.6131.193321393.4138.0K11 521.481 452.031 401.721 407.86K2404.181 370.801 366.881 361.23K31 228.231 331.051 385.281 384.79R293.25120.9834.8546.63K1373.13414.13397.52411.60K2450.77409.12413.10414.32K3412.59413.24425.86410.57R77.655.0128.343.74

表7 白芥子乙醇回流提取方差分析結果

Tab.7Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofwhitemustardseed

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)14 523.992.007 262.0071.69<0.05單甘酯(B)2 535.002.001 267.5012.51>0.05凡士林(C)202.602.00101.301.00>0.05甘油(D)362.342.00181.171.79>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

表8 甘遂乙醇回流提取方差分析結果

Tab.8Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofeuphorbia

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)1 004.972.00502.48403.20<0.01單甘酯(B)4.772.002.381.91>0.05凡士林(C)134.272.0067.1453.87<0.05甘油(D)2.492.001.251.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

以細辛脂素含量為評價指標，由直觀分析極差R可知影響超臨界CO2的因素大小順序為：A>B>D>C，優選條件為A2B1C2D1；以延胡索乙素含量為評價指標，由直觀分析極差R可知影響回流的因素大小順序為A>D>C>B，選擇A2B2C2D3；從表8和表9結果可以看出，僅萃取釜壓力對延胡索和細辛的提取效果產生顯著影響(P<0.05)。綜合兩項實驗結果，確定超臨界CO2萃取優選工藝條件為：萃取壓力25 Mpa，萃取溫度40 ℃，95%乙醇為夾帶劑，其用量為藥材用量的3倍。

表9 細辛和延胡索超臨界CO2萃取正交實驗結果

Tab.9OrthogonalexperimentresultsofsupercriticalCO2extractionprocessofasarumandcorydalis

序號因素石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)細辛脂素延胡索乙素(μg·mL-1)1111150.040.12122241.841.53133339.242.64212376.257.95223168.553.86231266.152.17313260.443.28321363.150.29332162.647.7K1131.06186.61179.14181.20K2210.86173.44180.71168.26K3186.08167.96168.16178.56R79.7918.6412.5512.94K1124.14141.04142.25141.53K2163.74145.54147.08136.77K3141.07142.38139.62150.65R39.614.507.4613.87

表10 細辛超臨界CO2萃取的方差分析結果

Tab.10ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofasarum

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)1111.972.00555.9935.68<0.05單甘酯(B)61.222.0030.611.96>0.05凡士林(C)31.182.0015.591.00>0.05甘油(D)31.172.0015.581.00

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

表11 延胡索超臨界CO2萃取的方差分析結果

Tab.11ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofcorydalis

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)263.272.00131.6374.01<0.05單甘酯(B)3.562.001.781.00凡士林(C)9.552.004.772.68>0.05甘油(D)33.132.0016.579.31>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

2.9乳化型膏貼基質配比的正交實驗結果 乳化型膏貼基質配比的正交實驗結果見表12，13，綜合評分方差分析結果見表14。

表12 乳化型膏貼基質配比的正交實驗結果

Tab.12Orthogonalexperimentresultsofmatrixratioofemulsionpaste

序號石蠟(A)單甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)g綜合評分12211142242216328331044223145443112648121476232886413109682112K140363838K240384238K330363034R102124

表13 基質配比正交實驗綜合評分計算

Tab.13Comprehensivescoresoforthogonalexperimentonmatrixratio

實驗號軟硬度黏性均勻度熔化性綜合評分14(適中)2(太黏)441424(適中)4(適中)441632(太軟)2(不黏)241042(偏軟)4(適中)441452(偏軟)2(太黏)441264(適中)4(適中)241472(偏軟)2(太黏)22882(偏硬)2(不黏)241092(偏軟)2(太黏)4412

表14 基質配比正交實驗的方差分析結果

Tab.14Resultsofvarianceanalysisonorthogonalexperimentofmatrixratio

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值石蠟(A)22.222.0011.1125.00<0.05單甘酯(B)0.892.000.441.00凡士林(C)24.892.0012.4428.00<0.05甘油(D)3.562.001.781.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

由表12，14結果可知，石蠟與凡士林用量是影響基質成型的關鍵因素，直觀分析極差R顯示影響因素大小順序為C>A>D>B，優選配比為A1B2C2D1，即將石蠟2 g，單甘酯4 g，凡士林2 g分別加熱熔化后，與甘油1 g混合均勻制成乳化型膏貼基質。

2.10乳化型膏貼劑型的體外經皮滲透實驗 筆者在本研究前期將白芥子涂方藥材提取物制備為高含水量的巴布凝膠劑型[4]，并利用改良Franze透皮擴散裝置，進行了兩種基質類型膏貼劑的離體大鼠皮膚透皮比較實驗，結果見圖2。從研究結果可以看出，對于細辛酯素和延胡索乙素兩項透皮指標，乳化型膏貼的累積滲透量均明顯高于巴布凝膠劑型，這可能是由于前者具有較高的載藥量以及較好的皮膚角質層親和能力與水化作用。

3 討論

白芥子涂方穴位敷貼以原粉入藥，不僅有效成分含量低，而且不利于質量控制，筆者在本研究采用超臨界CO2萃取技術對目標成分進行選擇性高效提取[4]，并采用HPLC法對其含量進行控制，制備出具有乳化性質的硬膏劑型。該劑型與其他外用膏貼劑相比在載藥量、熔化性、均勻性、乳化性能、透皮性能方面具有顯著特點，同時體外經皮滲透實驗驗證了超臨界CO2萃取技術應用于經皮給藥制劑脂溶性有效成分提取的可行性與合理性，為進一步研究指標成分透皮行為奠定基礎。

有研究證實，白芥子中芥子酶活性[6]，以及甘遂中大戟二萜醇濃度[7-8]是引起皮膚刺激性的關鍵影響因素，有效控制系統中這兩種成分濃度水平以及釋放速率，可有效避免目前白芥子涂方皮膚刺激性大和質量不可控的弊端。