綠原酸對脂多糖誘導的急性腎損傷小鼠的保護作用

徐靜紅，毛艷菲

(浙江省麗水市中心醫院病區藥房，麗水 323000)

膿毒癥是一種常見、復雜且致命的感染并發癥，通常由免疫反應釋放大量的炎性細胞因子引起[1]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒癥的嚴重并發癥，有研究發現其由脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)所致[2]。脂多糖誘導疾病模型是闡明膿毒癥AKI機制和潛在治療方法的常用動物模型之一。脂多糖可誘導TLR4信號通路，進而誘導核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化和炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和白細胞介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)[3]。這些炎癥細胞因子可能導致腎損傷，使腎小球中性粒細胞浸潤和單核細胞轉移，特別是腎小球系膜周圍區域[4]。因此，通過抑制炎癥細胞因子產生可以有效治療腎損傷。據報道，植物多酚對多種炎癥性疾病有抗氧化和抗炎作用[5]，其抗氧化和抗自由基性能作用于酶活化、基因表達、信號轉導途徑，進而阻止或延遲炎癥性疾病發生。已有研究表明，多酚可以分解2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基，清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、羥自由基和超氧自由基，抑制低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，LDL)氧化，螯合銅離子，還原鐵離子[6-7]。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)是最常見的多酚之一，具有多重藥理活性、強效免疫保護、抗炎、抗菌和抗氧化特性[8]。此外，有研究發現綠原酸具有預防脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的作用[9]。研究發現，綠原酸可以減輕鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠的腎損傷。但綠原酸對脂多糖誘導AKI的保護作用報道較少見。筆者在本研究中探討綠原酸對脂多糖誘導小鼠AKI的治療作用。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 綠原酸購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110753-201415，含量≥98%)；脂多糖(批號：L-2880)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS，批號：P5368)購自Sigma 公司；血肌酐( serum creatinine，Scr，批號：T17P128B)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN，批號：EIABUN)、TNF-α(批號：168235001)、IL-6(批號：146735017)和IL-1β 酶聯免疫吸附測定(ELISA)(批號：147442015)試劑盒均購自eBioscience 公司；增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑購自Milipore公司(批號：WBKLS0100)；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(批號：P0028)、多功能電泳儀(型號：EEP102)購自中國碧云天生物技術有限公司；連續光譜掃描式酶標儀(型號：SpectraMax Plus384)購自美谷分子儀器有限公司。

1.2動物與處理方法 無特定病原體級(SPF)雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，購于維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，置于溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，12 h循環照明的環境中適應性飼養7 d，自由攝食和飲水。

采用隨機數字表法將50只小鼠隨機分成5組，每組10只：對照組、LPS組、LPS+CGA不同劑量(5，10，20 mg·kg-1)組。LPS組腹腔注射LPS溶液10 mg·kg-1；LPS+CGA組給予LPS1 h后腹腔注射0.9%氯化鈉溶液配制的綠原酸溶液。對照組腹腔注射PBS 20 mL·kg-1。在LPS刺激后24 h，處死小鼠并采集血液和腎組織。

1.3組織病理學檢查 10%甲醛固定腎組織并切片，石蠟包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。采用Jablonski半定量評分標準評價腎損傷程度[10]，0分為正常組織；腎小管損傷面積<5%為1 分；5%～25%為2 分；>25%～75%為3 分；> 75%為4 分。

1.4Scr和BUN測定 按照試劑盒說明書檢測Scr和BUN。

1.5TNF-α、IL-6和IL-1β的測定 根據說明書，采用ELISA試劑盒測定小鼠血清和腎組織TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.6Western bloting分析 使用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒提取腎臟組織蛋白質。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離總蛋白樣品(30 μg)，轉移到聚偏氟乙烯膜。室溫下5%脫脂乳封閉2 h，將封閉的膜與抗Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)(1：1000)，髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)(1：1000)，核因子κBp65(nuclear factor kappa-Bp65，NF-κBp65)(1：1000)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(phospho-inhibitor ofNF-κB，p-IκB)(1：1000)，核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)(1：1000)和β-肌動蛋白(β-actin)(1：2000)一抗4 ℃孵育過夜。將膜與二次抗體室溫孵育1 h，ECL試劑顯現免疫反應條帶。

2 結果

2.1腎組織病理特征 見圖1。LPS組腎臟病理損傷明顯，腎小管上皮細胞浸潤，腎囊腔擴張，管狀結構破壞，上皮細胞壞死，壞死細胞進入腔內小管。與LPS組比較，LPS+CGA 5，10和20 mg·kg-1組腎損傷明顯改善(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。

2.2Scr與BUN測定結果 與對照組比較，LPS組血清Scr和BUN顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+CGA各劑量組血清Scr與BUN顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

2.3TNF-α、IL-6和IL-1β測定結果 與對照組比較，LPS組血清和腎臟TNF-α、IL-6和IL-1β顯著增加(P<0.01)。與LPS組比較，LPS+CGA各劑量組血清和腎臟TNF-α、IL-6、IL-1β等含量下降(P<0.05或P<0.01)，且該作用呈劑量依賴性(圖3)。

2.4TLR4/NF-κB信號通路測定結果 見圖4，與對照組比較，LPS組誘導NF-κB活化和IκB分解，明顯增加TLR4和MyD88表達(P<0.05或P<0.01)；與LPS組比較，LPS+CGA各劑量組NF-κB p65和IκB磷酸化顯著抑制，且劑量依賴性地抑制LPS誘導TLR4和MyD88表達(P<0.05或P<0.01)。

A.對照組；B.LPS組；C.LPS+CGA 5 mg·kg-1組；D.LPS+CGA 10 mg·kg-1組；E.LPS+CGA 20 mg·kg-1組；F.腎損傷評分；與對照組比較，*1P<0.01；與LPS組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

圖1 5組小鼠腎組織病理學特征(HE，×200)

A.control group; B.LPS group; C.LPS+CGA 5 mg·kg-1group; D.LPS+CGA 10 mg·kg-1group; E.LPS+CGA 20 mg·kg-1group; F.renal injury score; compared with control group,*1P<0.01; compared with LPS group,*2P<0.05,*3P<0.01

Fig.1Pathologicalfeaturesofrenaltissueinfivegroupsofmice(HEstaining，×200)

A.BUN水平；B.血肌酐水平；與對照組比較，*1P<0.01；與LPS組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

圖2 5組小鼠BUN與Scr測定結果

A.BUN level; B.serum creatinine level; compared with control group,*1P<0.01; compared with LPS group,*2P<0.05,*3P<0.01

Fig.2DeterminationresultsofBUNandScrinfivegroupsofmice

3 討論

AKI常伴有嚴重并發癥，直接影響其他系統，并導致危重患者多器官功能衰竭[11]。嚴重并發癥導致AKI患者死亡率達到30%[12]。因此迫切需要探索新的治療途徑。綠原酸廣泛存在于中草藥，具有很強的抗炎作用[13]。本實驗中，與對照組比較，LPS組腎組織病理學及血清生化指標有明顯差異，腎小球結構被破壞，腎小管上皮細胞變性，腎小管和腎間質細胞存在嚴重的細胞內灌流和充血。此外，LPS組血Scr和BUN水平升高，腎功能不全。給予不同劑量綠原酸后，小鼠腎組織病理學變化減輕，血BUN和Scr水平降低。提示綠原酸可減輕脂多糖誘導的AKI。

脂多糖是導致膿毒癥或AKI的關鍵因素[14]。據報道，脂多糖所致炎癥細胞因子在AKI發病機制中發揮重要作用[15]。在脂多糖誘導AKI過程中，TNF-α、IL-1β和IL-6在血清和腎組織升高，脂多糖能誘導AKI發病相關炎癥細胞因子產生。越來越多的證據表明，抑制上述細胞因子可減輕AKI[16]。本研究結果表明，綠原酸呈劑量依賴性地抑制脂多糖誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6產生，抑制這些炎癥細胞因子的釋放是綠原酸對脂多糖誘導AKI的保護機制。

為進一步研究綠原酸抑制炎癥細胞因子產生的機制，本研究探索了綠原酸對TLR4/NF-κB信號通路活化的影響，該通路被認為是腎臟炎癥主要因素。脂多糖所致TLR4活化通過誘導炎癥細胞因子產生而傳導初期損傷，與引發炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達相關的NF-κB信號通路密切相關，已有證據表明減少TLR4和NF-κB介導的炎癥反應在各器官中有抵抗AKI的保護作用。

筆者在本實驗采用脂多糖誘導小鼠模型，研究綠原酸對AKI的保護機制，結果表明綠原酸可呈劑量依賴性地抑制磷酸化IκB的表達和NF-κB p65活性。此外，Western bloting分析研究MyD88和TLR4在腎組織中的表達，發現脂多糖刺激導致MyD88和TLR4的顯著表達，而綠原酸可減弱MyD88和TLR4的活化。

A.血清TNF-α含量；B.腎臟TNF-α含量；C.血清IL-1β含量；D.腎臟IL-1β含量；E.血清IL-6含量；F.腎臟IL-6含量；與對照組比較，*1P<0.01；與LPS組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

圖3 5組小鼠血清和腎臟TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定結果

A.serum TNF-α content; B.renal TNF-α content; C.serum IL-1β content; D.renal IL-1β content; E.serum IL-6 content; F.renal IL-6 content; compared with control group,*1P<0.01; compared with LPS group,*2P<0.05,*3P<0.01

Fig.3DeterminationresultsoftheserumandrenallevelsofTNF-α,IL-6andIL-1βinfivegroupsofmice

實驗結果表明，綠原酸可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化來減少脂多糖誘導AKI的促炎癥細胞因子。

與對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與LPS組比較，*3P<0.05，*4P<0.01

圖4 5組小鼠TLR4/NF-κB信號通路測定結果

Compared with control group,*1P<0.01，*2P<0.05; compared with LPS group,*3P<0.05,*4P<0.01

Fig.4DeterminationresultsofTLR4/NF-κBsignalingpathwayinfivegroupsofmice