酶的最適溫度的時間依賴性和溫度依賴性

楊洪斌（重慶市第七中學校 重慶 400030）

在探討溫度對酶的影響時，教師經常是根據教材中的“鐘型曲線”進行講授，即在酶的最適溫度前，酶的活性隨溫度的升高而升高；在酶的最適溫度后，酶的活性隨溫度的升高而降低。因此，在生產或實驗時要選擇酶的“最適溫度”作為反應的“最佳溫度”。這種觀點幾乎根深蒂固地存在于所有教學和各種教輔資料中。其實，所謂酶的“最適溫度”并沒有“最適”的說法。

1 溫度對酶穩定性的影響原理

在影響酶活性的所有因素中，溫度對其的影響最具挑戰性。溫度幾乎影響生化反應的各個方面，包括酶和底物的pH 依賴性、電離、金屬結合相互作用、酶構象變化、蛋白質的寡聚化、氫鍵、疏水相互作用及過渡態等。這些復雜的行為都與各種鍵相互作用及其與溫度相關的焓和熵變化有關。溫度對酶的影響主要表現在2 個方面：一是在一定溫度范圍內保持酶自身的熱穩定性或維持自身結構的穩定性；二是溫度會通過影響酶的活性位點的親和力影響酶的活性。一般情況下可通過以下方面增強酶對溫度的耐受性：1）選擇適宜的溶液pH 值；2）加入穩定配體（例如底物、輔因子、金屬離子及調節效應因子）；3）保護酶免受蛋白質水解；4）其他蛋白質（被稱為保護性膠體效應的蛋白質）的存在。由圖1［1］可知，在1～40℃內，溫度每升高10℃，反應速率就會增加一倍；但在高溫下，產物的形成速率迅速下降，且在達到平衡前酶的活性就消失了。

圖1 不同溫度下酶的產物的形成過程［1］

2 酶的穩定性與催化原理

酶的“微觀穩定性”與局部結構可逆變化相關的能量有關。微觀穩定性是造成酶活性位點的柔韌性或剛性的原因，這影響催化的底物或配體結合的位置［2］。酶的總體穩定性是宏觀穩定性與微觀穩定性之間的自由能差異［3］。由于較弱的分子相互作用，酶的活性位點比整體酶更靈活，且酶的活性位點會比整體蛋白質更快地失去其功能（加入化學變性劑或加熱后）變性［4］?！罢T導契合”模型假定酶活化是由于酶的活性位點與底物之間相互作用，進而引起酶活性位點的構象改變形成的?！安▌悠鹾稀蹦Ｐ捅砻?，酶的天然構象在溶液中存在多種狀態，這些酶的不同構象適用于不同溫度下酶能維持一定的功能。

3 平衡模型解釋溫度對酶活性的影響

酶活性對溫度的依賴性一般用“經典模型”進行描述，包含2 個過程：催化反應（用kcat描述）和不可逆失活（由kinact定義）。這些溫度依賴性的速率常數分別通過催化活化能和熱失活反應的活化能進行表征。最近，很多科學家都發現短時間內酶具有表觀最佳溫度。Thomas 和Scopes［5］的研 究表明，某些酶在高溫下的活性低于變性時所能解釋的活性。于是科學家提出了一個平衡模型。

其中酶活性形式（Eact）與非活性形式（Einact）處于平衡狀態，Einact是不活躍的形式。不可逆的熱失活到變性狀態（X）。平衡由平衡常數（Keq）描述。基于此，可進行如下轉換：

平衡用平衡時的焓（△Heq）和新的熱力學系數Teq進行表征；Teq表示活性酶（Eact）和無活性酶（Einact）濃度相等時的溫度，因此，它相當于熱力學平衡常數Km。通過繪圖，得到了圖2A［2］，成為了經典模型；當在A 圖的基礎上引入催化的活化能和不可逆反應的活化能后，就得到了圖2B［2］這樣的平衡模型。這個類似于“帳篷”的模型已經過了超過30 種酶的驗證［6］，是一種可靠的速率-溫度-時間三維平衡模型。當沒有發生變性時，所有表現出“帳篷”類型的酶的活性溫度在時間為零時表現最佳，而且研究表明Teq與穩定性無關。

圖2 速率-時間-溫度平衡模型［2］

4 酶的最適溫度并不是“最適”的原理

4.1 酶活性的時間依賴性和溫度依賴性 平衡模型提出后，有很多研究者對該模型進行了驗證。Peterson 等［3］用芳基酰基酰胺酶做了一個酶的速率-時間-溫度曲線，由圖3A 可知，酶的最佳活性是一個不斷變化的量，它會隨著時間和溫度的變化而變化。在溫度為58.5℃時，由于Eact／Einact平衡而導致酶的活性非常快速損失達到了60%。在相同溫度下，變性導致酶的活性損失只在幾分鐘內就完成了［6］。由圖3B［5］可知，在相同溫度下，酶的反應速率會隨著反應時間的變化而變化，也可以看出反應時間越短，其活性越高，催化的速率就越快；同樣，在相同的時間內，不同溫度下，酶的活性也不一樣［7］。無論是“帳篷”曲線還是用具體酶做實驗，都能體現出酶的活性并沒有一個固定的最佳活性，它會隨時間和溫度的變化而變化，表現出對時間和溫度的依賴性。

圖3 酶的活性對時間和溫度的依賴［3，5］

4.2 酶的最適溫度與不可逆變性 由于酶的活性具有對時間和溫度的依賴性，因此，酶并沒有最適溫度。圖4A 是一個常見的圖［8］，也是高中生物學教材和練習題中常見的溫度對酶的催化速率影響的示意圖。在平時的教學中，教師會解釋在最適溫度之前，隨著溫度升高，酶的催化活性升高，因此，酶反應速率會加快；超過最適溫度，酶的活性降低，酶反應速率下降；過高的溫度會導致酶不可逆變性，這個“高溫”是全部酶都失活的溫度。由圖4A［8］可知，這種說法是不正確的。在“最適溫度”之前，酶的變性是一種可逆的變性；但是一旦超過了最適溫度，酶就開始變性，而且這種變性是一種不可逆的變性，所以“最適溫度”實際上是酶開始發生不可逆變性的溫度。因此，在實際的生產和應用中，并不會選擇這樣一個“最適溫度”作為酶的反應溫度。同時由圖4B［8］可知，溫度誘導的催化活化和溫度誘導的失活，取決于這2 個過程相應的過渡態的能量。將溫度升高到可逆范圍內會導致酶有更高的活性，降低溫度會使酶的活性恢復到其原始活性。當發生不可逆變性時，冷卻至較低溫度則不會恢復催化活性，構象的靈活性是許多酶在熱變性和不可逆的催化活性損失方面的弱點。

圖4 酶在不同溫度下的失活過程［8］

5 研究進展

溫度對酶的影響非常復雜。溫度過高時，酶會發生不可逆變性；變性是一個復雜的化學過程，既要考慮到蛋白質的大小和三維結構，又要考慮溫度會影響酶在構象變化之前或之后的化學反應。目前，科學家還在研究不同溫度環境下生物體內酶活性的變化，主要將酶分為冷適應的酶和嗜熱酶。研究表明，冷適應酶具有更靈活的活性位點［9］，其通過弱化酶活性位點中的分子內力而產生；而嗜熱酶的活性位點則更加剛硬［10］。冷適應酶和嗜熱酶的靈活性變化是由于活性位點的氨基酸結構變化導致的。冷適應的微生物可以產生冷適應的酶，它們能在比嗜溫生物更低的溫度下調節自身結構進行催化反應。冷適應酶在其最適溫度范圍內的熱穩定性范圍是有限的，因為在低溫下構象變化會隨溫度增加而增加，會導致酶活性位點的功能在蛋白質的3D 結構變性之前喪失，在其最適溫度下具有更剛性的活性位點［11］。嗜熱酶的活性位點的靈活性在其最適溫度下靈活性最大?？傊傅撵`活性和生物生活的環境密切相關，這可能是生物在進化過程中對棲息環境的一種適應。已有的研究表明，酶的活性具有時間和溫度的依賴性，因此，酶并沒有“最適溫度”。酶的活性是一個隨溫度和時間變化而變化的量，同時，平時所謂的“最適溫度”其實是酶發生不可逆變性的溫度。