131I標記適配子的優化研究及其穩定性的

許杰華?張桂雄?楊敏?黃文山

【摘要】目的 探討用氯氨T法和Iodogen法進行適配子的131I標記的可行性及標記產物在不同條件下的穩定性。方法 用氯氨T法和Iodogen法分別對適配子進行131I的標記，用紙層析法測定2種方法不同反應時間的標記率，測定標記產物在不同條件下的穩定性。結果 2種方法在反應時間為1 min時的標記率分別為（94.11±0.30） %和（94.01±0.07） %，比較差異無統計學意義（P > 0.05）;置于4℃與室溫24 h后，標記產物在磷酸鹽緩沖液（PBS）、無血清培養基、含10%血清培養基、純血清中的放射性化學純度分別為（97.46±0.77） %、（94.76±1.57） %、（85.18±2.27） %、（67.96±1.91） %與（95.78±1.98） %、（56.11±4.06） %、（23.96±3.76） %、（9.45±1.75） %，除PBE介質外，標記產物在4℃條件與室溫條件下的放射性化學純度均有差異（P均 < 0.001）;2種溫度條件下標記產物在無血清培養基與含10%血清培養基中的放射性化學純度均有差異（P均 < 0.001）。結論 氯氨T法和Iodogen法均可高效標記適配子，標記產物在低溫及無血清條件中穩定性更好。

【關鍵詞】適配子;氯氨T法;Iodogen法;131I;穩定性

Optimization and evaluation of the stability of 131I labeling aptamer Xu Jiehua， Zhang Guixiong， Yang Min， Huang Wenshan. Department of Nuclear Medicine， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Xu Jiehua， E-mail： xujhgz3@163.com

【Abstract】Objective To investigate the feasibility of labeling aptamer with 131I using chloramine-T or Iodogen methods and evaluate its stability under different conditions. ?Methods Aptamer was labeled with 131I using the chloramine-T and Iodogen methods. The labeling rate of different reaction times were measured by paper chromatography. The stability of labeled products under different conditions was determined. Results The labeling rates of two methods at 1 min of reaction time were （94.11±0.30） % and （94.01±0.07） %， respectively， there was no significant difference between them （P > 0.05）. The radiochemical purity of labeled products in phosphate buffer（PBS）， serum-free medium， 10% serum medium and serum were （97.46±0.77） %， （94.76±1.57） %， （85.18±2.27） % and （67.96±1.91） % at 4℃for 24 h， （95.78 ±1.98） %， （56.11±4.06） %， （23.96±3.76） % and （9.45±1.75） % at room temperature for 24 h， respectively. Statistical significance was observed under two temperature conditions in serum-free medium， 10% serum medium and serum （all P < 0.001）. At 44℃ and room temperature， the radiochemical purity of labeled products in the serum-free medium and 10% serum medium significantly differed （both P < 0.001）. Conclusion Both chloramine-T and Iodogen methods can efficiently label the aptamer， and the labeling products have better stability under low temperature and serum-free conditions.

【Key words】Aptamer;Chloramine-T;Iodogen;131I;Stability

寡核苷酸適配子（aptamer）是用指數富集配基的系統進化（SELEX）技術，通過體外篩選、擴增和富集獲得能與多肽、蛋白質、細胞器、核酸以及細胞和組織等靶物質高親和力、高特異性結合的單鏈DNA/RNA寡核苷酸[1-3]。本課題組在前期實驗中利用基于細胞的SELEX技術（Cell-SELEX技術）篩選出多條對肝癌細胞HepG2細胞株具有高度靶向性及親和力的適配子JHIT1 ～ JHIT7 （ssDNA），其中JHIT2的親和力最佳，然后對適配子JHIT2用Iodogen法進行131I的直接標記，但該法的標記率較低且穩定性較差[4-5]。在適配子篩選的過程中，我們對適配子進行了熒光標記[羧基熒光素（FAM）、FITC、Cy5等]用于流式細胞技術及體外熒光顯像試驗以探討其靶向性與親和力。適配子的熒光標記簡單易行，可由公司直接合成及純化。在這過程中，我們發現適配子連接上功能基團FAM后，FAM可提供多個131I標記的位點，為標記提供了結構基礎，預計該法的標記效率會比直接標記法高。在本研究中，我們將在前期研究中篩選出的適配子JHIT2的末端連接上功能基團FAM，分別用氯氨T法及Iodogen法對其進行131I標記，比較2種標記法的標記效能，并研究其標記產物在不同條件下的穩定性，為適配子介導肝癌的靶向放射顯像或靶向放射治療奠定基礎。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS，江蘇產），無載體Na131I溶液（廣東產）;Pierce Pre-Coated 碘化管（美國產），SephadexG-25、氯氨T （上海產），偏重亞硫酸鈉（廣東產），3MM色譜層析濾紙（英國產），玻璃毛細管（0.3 × 100 mm，四川產），GC-1200 γ放射免疫計數器（安徽產）。

二、實驗方法

1.功能基團FAM與肝癌適配子JHIT2的連接

適配子JHIT2 （序列為5-AGAGACCCTGACTGCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGGACACGGTGGCTTCTT-3）的5末端連接上功能基團 FAM構成FAM-JHIT2;適配子JHIT2及FAM-JHIT2均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經過高效液相色譜法（HPLC）純化。

2. 131I標記FAM-JHIT2

2.1 氯氨T法

由低溫冰箱中取出FAM-JHIT2 33 μg，5000

轉/分離心2 min使其沉淀，然后加入100 μl PBS備用。在1 ml試管中依次加入FAM-JHIT2、50 μl （約

5.2 MBq）的Na131I溶液及50 μl氯氨T （1 mg/ml），充分混勻，在室溫下反應0.5、1、2、4、8 min后加入50 μl的偏重亞硫酸鈉（2 mg/ml）終止反應。

2.2 Iodogen法

由低溫冰箱中取出FAM-JHIT2 33 μg，5000 轉/分離心2 min使其沉淀，然后加入100 μl PBS備用。在Pre-Coated碘化管中依次加入FAM-JHIT2、5.2 MBq的Na131I溶液，充分混勻，在室溫下反應0.5、1、2、4、8 min后取出反應液即可終止反應。

3.氯氨T法及 Iodogen法標記率測定

用紙層析法測標記率，以色譜層析濾紙（2 cm×16 cm）為固定相，用毛細管取標記完成的溶液3 ～ 5 μl點樣于層析紙的原點處，以甲醇∶水為85∶15為展開劑進行紙層析。將層析后的紙條每隔1 cm剪開，測定每小段的放射性計數。標記率（%） = 產品峰的放射性計數/（產品峰的放射性計數+游離131I 峰的放射性計數）×100%。

4.標記產物的純化及放射性化學純度測定

用經PBS平衡后的SephadexG-25柱（中顆粒，柱規格0. 5 cm×10 cm）進行離心（1200 轉/分，5 min）純化，用蒸餾水洗脫，洗脫液用試管收集。放射性化學純度用紙層析法測定，方法與標記率測定相同。

5.標記產物的體外穩定性

將純化后的標記產物（740 KBq， 50 μl）以體積比為1∶1的比例分別與PBS、無血清培養基、含10 %血清的培養基、純血清混合，分別置于4℃及室溫下于1、2、4、8、12、24 h后用紙層析法測定其放射性化學純度，比較其在不同條件下的穩定性。每組實驗重復測定3 ～ 4次。

三、統計學處理

運用GraphPad Prism 6處理數據，計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、FAM與適配子JHIT2的連接

適配子JHIT2的5末端連接上功能基團FAM獲得FAM-JHIT2，見圖1。

二、氯氨T法及 Iodogen法標記FAM-JHIT2的標記率和放化純度

對比游離131I空白對照在層析紙上的遷移情況，可知第一峰為131I標記FAM-JHIT2后的標

記產品峰（相對遷移率Rf 0 ～ 0.1），第二峰為游

離的131I 峰（相對遷移率Rf 0.8 ～ 0.9），見圖2。氯氨T法室溫下反應0.5、1、2、4、8 min后的標記率分別為（93.29±0.84） %、（94.11±0.30） %、

（93.85±0.22） %、（93.05±0.72） %、（84.70 ±2.58） %，見圖3A。Iodogen法室溫下反應0.5、1、2、4、8 min后的標記率分別為（92.12±0.18） %、

（94.01±0.07） %、（93.47±0.21） %、（90.95 ±0.18） %、（81.26±2.77） %，見圖3B。2種標記

方法的標記效能無差異（P > 0.05），且均在1 min

反應時間時標記率最高。因Iodogen法采用的Pierce Pre-Coated 碘化管不易購買且較貴，故后續實驗均采用氯氨T進行131I 標記實驗。標記產物經SephadexG-25柱純化后放射性化學純度為（98.55±0.08） %。

三、不同溶液和溫度條件下標記產物的穩定性

24 h后在PBS介質中，4℃條件與室溫條件下標記產物的放射性化學純度無差異（P > 0.05）。在無血清培養基、含10%血清培養基及純血清3種介質中，4℃條件與室溫條件下標記產物的放射性化學純度均有差異（P均 < 0.001）。4℃條件與室溫條件下標記產物在無血清培養基與含10%血清培養基中的放射性化學純度均有差異（P均 < 0.001），見表1。

討論

寡核苷酸適配子具有類抗體作用，且可克服抗體的多項缺點，是一種具有應用前景的新型分子靶向探針。與抗體相比，寡核苷酸適配子具有靶分子范圍廣泛、特異性高、親和力強、易于人工合成、穩定性好、易修飾、無毒性和缺乏免疫原性等獨特優勢[2-3]。自適配子問世以來，已有不少關于適配子介導核素進行體內外放射性核素顯像或治療的研究報道。例如，Jacobson等[6]利用點擊化學技術進行適配子的18F標記，合成由適配子介導的18F顯像探針，在動物實驗中獲得較好的顯像效果;Varmira等[7]利用99mTc標記的靶向人表皮生長因子受體-2（HER2）的適配子進行單光子發射及X射線計算機斷層成像系統（SPECT/CT）顯像研究等。Zhu等（2015年）指出，131I為臨床常用核素，其具有較長的半衰期（T1/2 = 8.01 d），可發射γ射線用于SPECT成像和發射β射線用于放射治療，且其標記方法簡單易行，標記產物穩定，在實驗研究中已被廣泛應用。

適配子JHIT2本質是一條含有61個核苷酸的單鏈DNA。之前已有多項關于125I（或131I）標記核苷酸鏈的研究[李丹等（2010年）、歐曉紅等（2006年）、王榮福等（2004年）、劉生等（2004年）的研究]，但存在直接標記的標記效率低下和穩定性差或標記時需要連接螯合劑導致實驗過程煩瑣等缺點。本研究以本課題組前期實驗中篩選出的適配子 JHIT2為基礎，在其末端連接上功能基團FAM為131I標記提供位點，避免對適配子鏈進行直接標記而導致其結構的破壞，并提高標記效能和標記產物的穩定性。結果顯示，氯氨T法和Iodogen法的標記率在反應時間4 min內較佳，可達90%以上;其中反應時間為1 min時，標記率最好，可達94%以上，遠高于課題組前期實驗中131I直接標記適配子的標記率（67.8±0.5）%和歐曉紅等（2006年）用131I直接標記寡核苷酸鏈的標記率（37.6±2.4）%。另外，標記產物于PBS中24 h后放射性化學純度仍大于90%，且低溫可提高其穩定性，有利于該標記產物的保存和運輸;標記產物無論是在低溫或室溫條件下置于含血清的培養基或純血清時的穩定性均降低，這可能是血清中含有的核酸酶對適配子鏈的降解所致，但低溫可抑制核酸酶的活性，從而減緩核酸鏈的降解，提高標記產物的穩定性。

綜上所述，在本研究中，我們通過在適配子的末端連接上功能基團FAM提供多個131I標記的位點，為131I的標記提供結構基礎，然后分別用氯氨T法和Iodogen法對其進行131I標記，結果顯示2種標記方法均能獲得較高的標記率，且反應時間僅需1 min。標記產物在無血清條件中穩定性好，且低溫可提高標記產物的穩定性。本研究為適配子介導的肝癌靶向放射顯像和放射治療奠定了基礎。我們將在之后的研究中探討131I標記的適配子進行靶向肝癌顯像的可能性，必要時對適配子進行相應的穩定性修飾，提高其在血清中的穩定性，以便更好地應用于體內。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-06-22）

（本文編輯：洪悅民）