p66Shc在綿羊卵母細胞中的表達及其與胞質氧化還原穩態的關系

張通 ，栗瑞蘭 ，范曉梅 ，劉春潔，海日汗，霍敏，張家新

（1內蒙古農業大學動物科學學院/內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018；2山西大同大學醫學院，山西大同 037009；3內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010110）

0 引言

【研究意義】哺乳動物胚胎體外生產效率低，很大程度上與卵母細胞和胚胎暴露于不利的體外培養環境中造成的氧化應激有關[1-2]。哺乳動物卵母細胞胞質氧化還原穩態失衡是影響卵母細胞體外成熟質量以及胚胎發育潛能的關鍵因素。近年的研究表明，原癌基因 SHC編碼的亞型 66KD線粒體氧化應激蛋白（p66Shc）及其信號特性在調控細胞氧化應激、細胞凋亡和機體衰老過程中發揮了重要作用[3-4]。因此，如果能從卵母細胞入手，研究p66Shc基因調控卵母細胞線粒體氧化還原代謝機制，從基因角度探究改善胚胎抗氧化應激能力的方法，從基因角度改善胚胎抗氧化應激能力，這對于優化家畜胚胎體外生產體系和提升人類輔助生殖技術水平具有重要的理論意義和現實意義。【前人研究進展】p66Shc作為少數確定的哺乳動物氧化應激調控基因之一。在小鼠模型中發現，p66Shc基因缺失突變體能增強細胞對活性氧類物質的抗性并延長機體壽命[5]，還能抵制年齡相關的疾病，如動脈粥樣硬化[6]，內皮紊亂[7]，糖尿病依賴性腎小球病[8]和乙醇誘導的肝病[9]等。哺乳動物卵母細胞和胚胎體外發育遲緩、阻滯很大程度上是由氧化應激引起胞質氧化還原穩態失衡所導致。有報道表明哺乳動物早期胚胎發育阻滯與線粒體氧化應激蛋白 p66Shc的表達有關[10-12]。REN等[13]表明，砷可以顯著誘導小鼠2-cell早期胚胎的發育阻滯和線粒體氧化應激蛋白p66Shc的表達上調。通過顯微注射p66Shc的siRNA到小鼠的受精卵原核，結果導致p66Shc mRNA和蛋白水平以及活性氧水平的顯著下降，從而使砷誘導的2-cell阻滯減少，同時桑椹胚發育率得到提高。此外，BETTS等[14]在牛合子階段同樣利用p66Shc RNA干擾技術，數據表明p66Shc敲除的胚胎表現出細胞內ROS水平降低、DNA損傷減少、錳過氧化物歧化酶（MnSOD）表達水平升高，胚胎發育至囊胚階段的比例升高。上述結果表明p66Shc敲除能夠顯著增加胚胎的氧化應激抗性改善體外胚胎的發育能力。【本研究切入點】哺乳動物卵母細胞胞質氧化還原穩態的維持對于卵母細胞成熟質量以及發育能力的獲得至關重要。p66Shc作為細胞內氧化還原穩態調控的重要感受蛋白，開展探究p66Shc對綿羊卵母細胞胞質氧化還原穩態調控的分子機制具有重要意義。但迄今報道關于p66Shc在哺乳動物卵母細胞中的表達及其對氧化應激反應調控的文獻較少。【擬解決的關鍵問題】本研究比較分析了成熟前后不同質量卵母細胞中 p66Shc mRNA和蛋白的表達規律、線粒體分布與活性、ROS水平以及氧化還原穩態，為進一步研究p66Shc調控綿羊卵母細胞氧化還原機制以及 p66Shc的功能提供重要的理論參考。

1 材料與方法

試驗于 2017年在內蒙古農業大學動物遺傳育種與繁殖重點實驗室完成。

1.1 試劑與藥品

TCM-199培養液，含 Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, DPBS），青鏈霉素合劑（Penicillin-Streptomycin, PS）均為Gibco公司產品；促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）購自Bioniche公司；雌二醇（E2）、胎牛血清（FBS）、透明質酸酶（Hya）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯醇（PVA）、半胱胺均購自Sigma公司；p66Shc兔源一抗和 Alexa 488標記的山羊抗兔的二抗均購自Proteintech公司，MitoTracker? Red CMXRos購自Invitrogen公司；活性氧檢測試劑盒購自Beyotime公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵母細胞的采集與體外成熟 試驗所用綿羊卵巢來源于呼和浩特屠宰場，用添加有青鏈霉素的滅菌生理鹽水清洗卵巢3次，然后放入37℃水浴鍋內保溫。從卵巢表面抽取直徑為3—6 mm的卵泡，在體視顯微鏡下挑選卵母細胞。根據卵母細胞質均勻程度、卵丘細胞形態及其與卵母細胞結合的緊密程度分為優質和劣質卵母細胞，優質（high quality, HQ）卵母細胞：形狀規則、胞質均勻、色澤一致、卵丘細胞層包裹緊密完整（圖1-a）；劣質（poor quality, PQ）卵母細胞：形狀規則，胞質不均、色澤不一，卵丘細胞包裹不完整（圖 1-b）。選用優質卵母細胞用于體外成熟，分為常規24 h成熟組 (圖1-c) 和成熟30 h老化組 (圖 1-d)。成熟培養液為：TCM-199+10% (v：v)FBS+1% (v：v) PS + 10 μg·mL-1FSH +10 μg·mL-1LH +1 μg·mL-1E2+100 nmol·L-1半胱胺。

1.2.2 實時熒光定量 PCR 分別收集成熟前優質卵母細胞、劣質卵母細胞、常規成熟24 h卵母細胞、老化組的卵母細胞，每組樣品收集卵母細胞數為50枚。按照RNeasy Mini kit (Qiagen)微量樣品總RNA提取試劑盒提取卵母細胞的總RNA，用Takara反轉錄試劑盒合成cDNA，并將所得cDNA置于-80℃保存備用。根據GenBank查找綿羊的 p66Shc序列和β-actin序列，利用Primer 5.0設計引物，引物序列見表 1，由上海生工合成，以反轉錄得到的 cDNA作為模板，以SYBR為熒光染料，用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進行熒光定量PCR擴增，每組試驗重復 3次。以 β-actin為內參，根據 2-ΔΔCt計算p66Shc相對表達量。

1.2.3 線粒體染色和細胞免疫熒光 分別收集成熟前優質卵母細胞、劣質卵母細胞、常規成熟24 h卵母細胞、老化組的卵母細胞，渦旋處理以去除卵丘細胞。裸卵在含有0.01% PVA的PBS緩沖液中洗滌3次，轉入 500 nmol·L-1MitoTracker Red CMXRos（Cat＃M7512, Invitrogen, USA）孵育30 min，使用4%多聚甲醛室溫固定 15 min，將固定的卵母細胞在 0.1%Triton X-100的PBS中透化20 min，隨后在5%山羊血清中室溫封閉 1 h，將卵母細胞在 p66Shc兔源一抗（Proteintech）（1∶100）中4℃孵育過夜。將洗滌后的卵母細胞轉入二抗（Alexa 488標記的山羊抗兔）孵育 30 min，用 1 μg·mL-1DAPI染色 15 min。將染色的卵母細胞轉移到 35 mm的共焦皿中，并在 Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察。檢測 p66Shc（Ex：495 nm; Em： 519 nm），MitoTracker Red（Ex： 578 nm;Em： 598 nm）和 DAPI（Ex： 359 nm; Em： 461 nm）。每組試驗重復3次，使用Image J軟件進行圖像分析。

1.2.4 ROS檢測 分別收集成熟前優質卵母細胞、劣質卵母細胞、常規成熟24 h卵母細胞、老化組的卵母細胞各 30枚，渦旋處理以去除卵丘細胞，轉入含有200 μL 10 mmol·L-1ROS 水平檢測工作液（DCFH-DA)的平皿中，置于39℃培養箱中孵育30 min，將染色的卵母細胞轉移到 35 mm的共焦皿中，并在 Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察檢測FITC（Ex： 495 nm; Em： 519 nm）。每組試驗重復3次，使用Image J軟件進行圖像分析。

1.2.5 氧化還原穩態檢測 分別收集成熟前優質卵母細胞、劣質卵母細胞、常規成熟24 h卵母細胞、老化組的卵母細胞各30枚，渦旋處理以去除卵丘細胞，將卵母細胞轉移到35 mm的共焦皿中，并在Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察。檢測FAD++（Ex：490 nm; Em： 540 nm）和 NAD(P)H（Ex： 420 nm; Em：460 nm）。每組試驗重復3次，使用Image J軟件進行圖像分析。

1.2.6 過氧化氫誘導處理 收集成熟前優質卵母細胞，分為對照組（30 min和 1 h）、處理組（100 μmol·L-1H2O2處理30 min和1 h），每組樣品20枚卵母細胞，首先比較對照組和處理組 ROS水平和氧化還原穩態的變化，然后檢測H2O2誘導的氧化應激對p66Shc蛋白表達影響。將卵母細胞在p66Shc兔源一抗（Proteintech）（1： 100）中4℃孵育過夜。將洗滌后的卵母細胞轉入二抗（Alexa 488標記的山羊抗兔）孵育30 min，用1μg·mL-1DAPI染色15 min。將染色的卵母細胞轉移到35 mm的共焦皿中，并在Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察。檢測p66Shc（Ex： 495 nm; Em： 519 nm）。每組試驗重復3次，使用Image J軟件進行圖像分析。

圖1 成熟前后不同質量的綿羊卵母細胞Fig. 1 Different quality sheep oocytes before and after maturation

1.3 統計分析

采用SPSS軟件中的 ANAVO 進行單因素方差分析和顯著性檢驗。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 p66Shc在成熟前后不同質量卵母細胞中的相對表達量

如圖2所示，RT-qPCR試驗分析結果表明，p66Shc在綿羊成熟前后不同質量卵母細胞中均有表達，成熟前劣質卵母細胞p66Shc mRNA的相對表達量顯著高于同時期優質的卵母細胞（P＜0.05）。成熟后老化的卵母細胞p66Shc mRNA的相對表達量顯著高于常規成熟24 h的卵母細胞（P＜0.05）。然而優質卵母細胞成熟前后p66Shc mRNA表達量沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 p66Shc在成熟前后不同質量卵母細胞中的相對表達量Fig. 2 The relative expression of p66Shc in different quality oocytes before and after maturation

2.2 p66Shc蛋白與線粒體在成熟前后不同質量卵母細胞的共定位

采用細胞免疫熒光技術和 MitoTracker Red線粒體探針對 p66Shc蛋白質和線粒體在綿羊成熟前后不同質量卵母細胞進行共定位，如圖3所示，p66Shc蛋白質在綿羊成熟前后不同質量卵母細胞中均有表達，且主要呈現周邊定位并且集中在線粒體分布活躍的區域。成熟前劣質卵母細胞p66Shc蛋白質表達量顯著高于成熟前優質卵母細胞（P＜0.05），成熟后老化的卵母細胞p66Shc蛋白質表達量顯著高于常規24 h成熟的卵母細胞（P＜0.05）。然而優質卵母細胞成熟后p66Shc蛋白表達顯著低于成熟前卵母細胞（P＞0.05）。成熟前卵母細胞線粒體在整個胞質中呈現明顯的周邊分布和中央彌散分布模式，成熟前優質卵母細胞線粒體活性顯著高于成熟前劣質卵母細胞。優質卵母細胞常規成熟后線粒體聚集在皮質區域，然而老化卵母細胞的線粒體分布出現紊亂。

圖3 p66Shc蛋白與線粒體在成熟前后不同質量卵母細胞的共定位Fig. 3 Co-localization of p66Shc protein and mitochondria in different quality oocytes before and after maturation

表1 p66Shc和β-actin基因引物序列Table 1 The oligonucleotide primer for p66Shc and β-actin

2.3 成熟前后不同質量卵母細胞的ROS水平

利用熒光探針DCFH-DA對成熟前后不同質量卵母細胞內ROS水平進行檢測，結果如圖4所示，成熟前劣質卵母細胞的 ROS水平顯著高于成熟前優質卵母細胞（P＜0.05），成熟后老化的卵母細胞的 ROS水平顯著高于常規24 h成熟的卵母細胞（P＜0.05），優質卵母細胞成熟后的 ROS水平顯著高于成熟前的卵母細胞（P＜0.05）。

圖4 不成熟前后不同質量卵母細胞的ROS水平Fig. 4 ROS levels of different quality oocytes before and after maturation

2.4 成熟前后不同質量綿羊卵母細胞的氧化還原穩態

通過檢測成熟前后不同質量綿羊卵母細胞FAD++/NAD(P)H比率來評價胞質氧化還原穩態。結果如圖5所示，成熟前劣質卵母細胞的FAD++/ NAD(P)H比率顯著高于成熟前優質卵母細胞（P＜0.05），成熟后老化卵母細胞的 FAD++/NAD(P)H比率顯著低于常規24 h成熟的卵母細胞（P＜0.05）。優質卵母細胞成熟前后 FAD++/NAD(P)H比率沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖5 成熟前后不同質量卵母細胞的氧化還原穩態Fig. 5 Redox homeostasis of different quality oocytes before and after maturation

2.5 過氧化氫誘導的氧化應激上調 p66Shc的表達

為了進一步研究p66Shc對氧化應激的反應，采用外源100 μmol·L-1H2O2處理成熟前優質綿羊卵母細胞，結果如圖 6所示，100 μmol·L-1H2O2處理 30 min和1 h誘導的氧化應激ROS水平顯著高于對照組（P＜0.05，圖6-A），FAD++/NAD(P)H比率顯著低于對照組(P＜0.05) (圖 6-B)。通過細胞免疫熒光表明H2O2誘導的氧化應激顯著上調p66Shc蛋白的表達(P＜0.05)，并且促使p66Shc由胞質向細胞核定位（圖6-C、D）。

圖6 過氧化氫誘導的氧化應激上調 p66Shc的表達Fig. 6 Hydrogen peroxide induced oxidative stress upregulated the expression of p66Shc

3 討論

活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）主要包括超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（HO·）等，這些都是氧化損傷的有效誘導劑并且參與氧化應激反應的調節，例如生殖細胞老化與凋亡、早期胚胎發育阻滯等[15-17]。有報道研究表明，體外胚胎生產過程中由于配子和胚胎暴露在外部環境下，內源性和外源性高水平的 ROS誘導的氧化應激反應可能導致基因表達和表觀遺傳修飾的改變以及細胞氧化還原穩態的紊亂，進而導致卵母細胞成熟質量差、早期植入前胚胎的發育阻滯和凋亡[18-19]。

p66Shc作為少數確定的哺乳動物氧化應激調控基因之一，在調控細胞氧化應激方面，主要表現為參與破壞線粒體的代謝網絡、引起細胞色素c的釋放和caspase的級聯活化[20-22]。因而從基因角度說，p66Shc介導的氧化應激被認為是細胞氧化損傷的關鍵基因。哺乳動物卵母細胞的氧化還原穩態是保證卵母細胞正常成熟和胚胎正常發育的關鍵性因素。在本研究中，從 mRNA和蛋白兩個水平對綿羊成熟前后不同質量卵母細胞氧化應激蛋白p66Shc mRNA的表達量進行了比較分析。實時熒光定量 PCR結果表明，p66Shc基因在成熟前劣質和成熟后老化卵母細胞 p66Shc mRNA的相對表達量都顯著高于成熟前優質和常規24 h成熟的卵母細胞，然而優質卵母細胞常規成熟前后沒有顯著差異（圖 2）。FAVETTA等[23]對氧化應激蛋白 p66Shc在正常發育與早期發育阻滯的牛胚胎表達的研究中，發現p66Shc mRNA在成熟前后的牛卵母細胞中表達沒有顯著差異，這與本研究的結果相似。BAIN等[11]在牛胚胎中發現胚胎質量差與p66Shc氧化應激蛋白高表達有關，因此推測p66Shc基因參與調控卵母細胞和早期胚胎氧化應激的能力。利用細胞免疫熒光結合MitoTracker Red探針對p66Shc和線粒體進行共定位，結果表明成熟前劣質和成熟后老化卵母細胞 p66Shc的蛋白表達顯著高于成熟前優質和常規24 h成熟的卵母細胞，這與mRNA表達模式一致（圖 3）。線粒體作為卵母細胞和胚胎能量代謝的核心，在卵母細胞體外成熟和胚胎發育期間的各種生物過程中起重要作用，越來越多的證據表明細胞質線粒體的區域再分布以及活性大小能夠作為哺乳動物卵母細胞發育能力的決定因素[24-25]。本研究中，比較分析了成熟前后不同質量綿羊卵母細胞線粒體的分布與活性，成熟前優質卵母細胞線粒體呈現周邊聚集和胞質的彌散分布模式（圖 3），這可能與成熟過程中的卵母細胞與外界能量交換密切對線粒體需求較多有關，成熟前劣質卵母細胞線粒體的活性顯著低于優質卵母細胞（圖3）。常規成熟24 h的卵母細胞線粒體更多地聚集到卵母細胞的皮質區域，這可能與卵母細胞為受精做準備有關，然而成熟30 h的卵母細胞線粒體分布模式紊亂（圖3）。總之，本研究的結果顯示，p66Shc表達水平的高低與線粒體的分布和活性反應了成熟前后卵母細胞的質量。

卵母細胞在正常生理條件下，ROS的產生和清除系統處于動態平衡狀態。由于種種原因，導致細胞內ROS過度產生而ROS清除能力下降，細胞就會出現氧化應激[26]。p66Shc對線粒體ROS代謝的調節依賴于線粒體呼吸鏈。研究發現p66Shc基因敲除小鼠的細胞內ROS的水平顯著降低，同時檢測到反映細胞氧化應激狀態的重要標志物—8-氧代脫氧鳥苷和硝基酪氨酸的下降[27]。為了進一步探究成熟前后不同質量卵母細胞p66Shc與ROS水平和氧化還原穩態的關系，筆者利用熒光探針DCFH-DA和卵母細胞自發熒光分別對成熟前后不同質量卵母細胞內 ROS水平和氧化還原穩態進行檢測，結果表明成熟前劣質和成熟后老化卵母細胞 ROS水平分別顯著高于成熟前優質和常規24 h成熟的卵母細胞（圖4），因此，卵母細胞質量差很大成程度上與ROS代謝失衡有關。TAKAHASHI等[28]同樣發現質量差的小鼠卵母細胞 ROS水平顯著高于正常的卵母細胞。FAD++/NADH熒光強度比稱之為氧化還原比，常用來確定細胞氧化還原狀態的相對變化來反映細胞代謝狀態的變化[29-30]。與成熟前優質和常規24 h成熟的卵母細胞相比，成熟前劣質和成熟后老化卵母細胞表現出氧化還原穩態失衡的狀態（圖5）。因此，卵母細胞質量下降與ROS水平升高及氧化還原穩態失衡有關。過氧化氫（H2O2）被廣泛用作外源 ROS的來源誘導氧化應激[31-32]，采用外源 100μmol·L-1H2O2分別誘導成熟前優質卵母細胞30 min和1 h，結果表明H2O2處理引起ROS顯著上升和氧化還原穩態的失衡，并且 H2O2誘導的氧化應激顯著上調p66Shc蛋白表達并促使 p66Shc由胞質向細胞核定位（圖6）。因此，p66shc在氧化應激條件下的表達上調，可能觸發了卵母細胞氧化應激“閘門”的開啟。但 p66shc對卵母細胞氧化應激反應的具體調節機制還需進一步研究。

4 結論

p66Shc在劣質和老化的綿羊卵母細胞中呈現高水平的表達特征，而且p66Shc高表達影響了綿羊卵母細胞胞質氧化還原穩態。